Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Toxoplasma gondii - гэта ўнутрыклетачны найпросты паразіт, які мадулюе мікраасяроддзе заражанага гаспадара і, як вядома, звязаны з частатой росту пухліны мозгу.У гэтым даследаванні мы мяркуем, што экзасомальная мікраРНК-21 з інфекцыі Toxoplasma спрыяе росту пухліны мозгу.Былі ахарактарызаваны экзасомы з мікрагліі BV2, заражанай таксаплазмай, і пацверджана інтэрналізацыя клетак глиомы U87.Профілі экспрэсіі экзасомальных мікраРНК былі прааналізаваны з выкарыстаннем масіваў мікраРНК і мікраРНК-21A-5p, звязаных з Toxoplasma gondii і сартаваннем пухлін.Мы таксама даследавалі ўзроўні мРНК генаў, звязаных з пухлінай, у клетках глиомы U87 шляхам змены ўзроўню міР-21 у экзасомах і ўплыў экзасом на праліферацыі клетак глиомы чалавека U87.У экзасомах клетак глиомы U87, заражаных Toxoplasma gondii, павышаецца экспрэсія микроРНК-21 і зніжаецца актыўнасць проціпухлінных генаў (FoxO1, PTEN і PDCD4).Экзасомы, атрыманыя з BV2, заражаныя таксаплазмай, выклікаюць праліферацыю клетак глиомы U87.Экзасомы выклікаюць рост клетак U87 у мышынай мадэлі пухліны.Мы мяркуем, што павелічэнне экзасомнай міР-21 у мікрагліі BV2, інфікаванай таксаплазмай, можа гуляць важную ролю ў якасці стымулятара клеткавага росту ў клетках глиомы U87 шляхам паніжэння рэгуляцыі супрацьпухлінных генаў.
Паводле ацэнак, у 2018 годзе ва ўсім свеце было дыягнаставана больш за 18,1 мільёна выпадкаў раку на запушчаных стадыях, прычым кожны год дыягнастуецца каля 297 000 пухлін цэнтральнай нервовай сістэмы (1,6% усіх пухлін)1.Папярэднія даследаванні паказалі, што фактары рызыкі развіцця пухлін галаўнога мозгу ў чалавека ўключаюць розныя хімічныя прадукты, сямейны анамнез і іанізуючае выпраменьванне ад тэрапеўтычнага і дыягнастычнага абсталявання для галавы.Аднак дакладная прычына гэтых злаякасных пухлін невядомая.Прыкладна 20% усіх ракавых захворванняў ва ўсім свеце выкліканыя інфекцыйнымі агентамі, у тым ліку вірусамі, бактэрыямі і паразітамі3,4.Інфекцыйныя ўзбуджальнікі парушаюць генетычныя механізмы клеткі-гаспадара, такія як аднаўленне ДНК і клеткавы цыкл, і могуць прывесці да хранічнага запалення і пашкоджання імуннай сістэмы5.
Інфекцыйныя агенты, звязаныя з ракам чалавека, з'яўляюцца найбольш распаўсюджанымі віруснымі ўзбуджальнікамі, уключаючы вірусы папіломы чалавека і вірусы гепатыту B і C.Паразіты таксама могуць гуляць патэнцыйную ролю ў развіцці рака чалавека.Некалькі відаў паразітаў, а менавіта Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis і Hymenolepis nana, былі датычныя да розных тыпаў раку чалавека 6,7,8.
Toxoplasma gondii - гэта ўнутрыклетачны найпросты, які рэгулюе мікраасяроддзе заражаных клетак гаспадара.Паводле ацэнак, гэты паразіт заражае прыкладна 30% насельніцтва свету, падвяргаючы рызыцы ўсё насельніцтва9,10.Toxoplasma gondii можа паражаць жыццёва важныя органы, уключаючы цэнтральную нервовую сістэму (ЦНС), і выклікаць сур'ёзныя захворванні, такія як смяротны менінгіт і энцэфаліт, асабліва ў пацыентаў з аслабленым імунітэтам9.Аднак Toxoplasma gondii можа таксама змяняць навакольнае асяроддзе заражанага гаспадара, мадулюючы рост клетак і імунныя рэакцыі ў імунакампетэнтных людзей, што прыводзіць да падтрымання бессімптомнай хранічнай інфекцыі9,11.Цікава, што, улічваючы карэляцыю паміж распаўсюджанасцю T. gondii і захворваннем пухлінай галаўнога мозгу, некаторыя паведамленні паказваюць, што in vivo змены навакольнага асяроддзя гаспадара з-за хранічнай інфекцыі T. gondii нагадваюць мікраасяроддзе пухліны.
Экзасомы вядомыя як міжклеткавыя камунікатары, якія дастаўляюць біялагічны кантэнт, уключаючы бялкі і нуклеінавыя кіслоты, з суседніх клетак16,17.Экзасомы могуць уплываць на звязаныя з пухлінай біялагічныя працэсы, такія як антыапоптоз, ангіягенез і метастазы ў мікраасяроддзі пухліны.У прыватнасці, мікраРНК (міРНК), невялікія некадзіруючыя РНК даўжынёй каля 22 нуклеатыдаў, з'яўляюцца важнымі рэгулятарамі генаў пасля транскрыпцыі, якія кантралююць больш за 30% мРНК чалавека праз індукаваны мікраРНК комплекс маўчання (miRISC).Toxoplasma gondii можа парушыць біялагічныя працэсы, кантралюючы экспрэсію мікраРНК у заражаных гаспадарах.МіРНК гаспадара ўтрымліваюць важныя сігналы для рэгулявання біялагічных працэсаў гаспадара для дасягнення стратэгіі выжывання паразіта.Такім чынам, вывучэнне змен у профілі мікраРНК гаспадара пры заражэнні T. gondii можа дапамагчы нам больш выразна зразумець узаемадзеянне паміж гаспадаром і T. gondii.Сапраўды, Thirugnanam і інш.15 выказалі здагадку, што T. gondii спрыяе канцэрагенезу галаўнога мозгу, змяняючы сваю экспрэсію на спецыфічных мікраРНК гаспадара, звязаных з ростам пухліны, і выявілі, што T. gondii можа выклікаць глиомы ў эксперыментальных жывёл.
Гэта даследаванне сканцэнтравана на змене экзасомальнай міР-21 у мікрагліі гаспадара, заражанай таксаплазмай BV2.Мы назіралі магчымую ролю змененай экзасомальнай міР-21 у росце клетак глиомы U87 з-за захавання ў ядры FoxO1/p27, які з'яўляецца мішэнню звышэкспрэсіі міР-21.
Экзасомы, атрыманыя з BV2, былі атрыманы з дапамогай дыферэнцыяльнага цэнтрыфугавання і правераны рознымі метадамі для прадухілення заражэння клеткавымі кампанентамі або іншымі везікуламі.Электрафарэз у SDS-поліакрыламідным гелі (SDS-PAGE) паказаў выразныя заканамернасці паміж вавёркамі, выцягнутымі з клетак BV2, і экзасомамі (малюнак 1A), і ўзоры былі ацэнены на наяўнасць Alix, які быў прааналізаваны Вестэрн-блоттингом экзасомальных бялковых маркераў.Маркіроўка Alix была знойдзена ў вавёрках экзасом, але не ў вавёрках лізата клетак BV2 (мал. 1B).Акрамя таго, вычышчаную РНК з экзасом, атрыманых з BV2, аналізавалі з дапамогай біяаналізатара.Рыбасомальныя субадзінкі 18S і 28S рэдка назіраліся ў схеме міграцыі экзасомальнай РНК, што паказвае на надзейную чысціню (малюнак 1C).Нарэшце, трансмісійная электронная мікраскапія паказала, што назіраныя экзасомы мелі памер каля 60-150 нм і мелі чашеобразную структуру, тыповую для марфалогіі экзасом (мал. 1D).
Характарыстыка экзасом, атрыманых з клетак BV2.(A) Старонка пашпарта бяспекі.Вавёркі вылучалі з клетак BV2 або экзасом, атрыманых з BV2.Патэрны бялку адрозніваюцца паміж клеткамі і экзасомамі.(B) Вестэрн-блот аналіз экзасомальнага маркера (Alix).(C) Ацэнка вычышчанай РНК з клетак BV2 і экзасом, атрыманых з BV2, з дапамогай біяаналізатара.Такім чынам, рыбасомныя субадзінак 18S і 28S у клетках BV2 рэдка выяўляюцца ў экзасомальнай РНК.(D) Трансмісійная электронная мікраскапія паказала, што экзасомы, вылучаныя з клетак BV2, негатыўна афарбоўваюцца 2% уранілацэтату.Экзасомы маюць памер прыблізна 60-150 нм і форму чашы (Сонг і Юнг, неапублікаваныя дадзеныя).
З дапамогай канфакальнай мікраскапіі назіралася клеткавая інтэрналізацыя экзасом, атрыманых з BV2, у клеткі гліёмы чалавека U87.Экзосомы, пазначаныя PKH26, лакалізаваны ў цытаплазме клетак U87.Ядра афарбоўвалі DAPI (мал. 2А), паказваючы, што экзасомы, атрыманыя з BV2, могуць быць засвоены клеткамі-гаспадарамі і ўплываць на навакольнае асяроддзе клетак-рэцыпіентаў.
Інтэрналізацыя экзасом, атрыманых з BV2, у клеткі гліёмы U87 і экзасомы, атрыманыя з BV2, заражаныя таксаплазмай RH, выклікала праліферацыю клетак гліёмы U87.(А) Экзасомы, ахопленыя клеткамі U87, вымераныя канфакальнай мікраскапіяй.Клеткі глиомы U87 інкубавалі з экзасомамі, пазначанымі PKH26 (чырвоным) або без кантролю на працягу 24 гадзін.Ядра афарбоўвалі DAPI (сінім), а затым назіралі пад канфакальным мікраскопам (шкала: 10 мкм, х 3000).(B) Праліферацыі клетак глиомы U87 вызначалі з дапамогай аналізу праліферацыі клетак.Клеткі глиомы U87 апрацоўвалі экзасомамі на працягу пазначанага часу. *P <0,05 было атрымана з дапамогай крытэрыю Сцьюдэнта. *P <0,05 было атрымана з дапамогай крытэрыю Сцьюдэнта. *P < 0,05 атрымана па t-крытэрыю Сцюдэнта. *P <0,05 па t-крытэрыі Сцьюдэнта. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, атрыманы з дапамогай t-крытэрыю Сцюдэнта. * P <0,05 атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцьюдэнта.
Пасля пацверджання інтэрналізацыі экзасом, атрыманых з BV2, у клеткі глиомы U87, мы правялі аналіз праліферацыі клетак, каб даследаваць ролю экзасом, атрыманых з таксаплазмы BV2, у развіцці клетак глиомы чалавека.Апрацоўка клетак U87 экзасомамі з клетак BV2, інфіцыраваных T. gondii, паказала, што экзасомы, атрыманыя з BV2, інфікаваныя T. gondii, выклікалі значна больш высокую праліферацыі клетак U87 у параўнанні з кантролем (мал. 2B).
Акрамя таго, рост клетак U118 меў тыя ж вынікі, што і U87, паколькі экзасомы, стымуляваныя таксаплазмай, выклікалі найбольшы ўзровень праліферацыі (дадзеныя не паказаны).Грунтуючыся на гэтых дадзеных, мы можам паказаць, што BV2-вытворныя Toxoplasma-інфікаваныя экзасомы гуляюць важную ролю ў праліферацыі клетак глиомы.
Каб даследаваць уплыў інфікаваных таксаплазмай BV2-вытворных экзасом на развіццё пухліны, мы ўвялі клеткі глиомы U87 голым мышам для мадэлі ксенотрансплантата і ўвялі BV2-вытворныя экзасомы або RH-інфікаваныя BV2-вытворныя экзасомы.Пасля таго, як пухліны сталі відавочнымі праз 1 тыдзень, кожную эксперыментальную групу з 5 мышэй падзялілі ў залежнасці ад памеру пухліны, каб вызначыць тую ж адпраўную кропку, і памер пухліны вымяралі на працягу 22 дзён.
У мышэй з мадэллю ксенотрансплантата U87 значна большы памер і вага пухліны назіраліся ў групе экзасомы, атрыманай з BV2, інфікаванай RH, на 22 дзень (мал. 3A, B).З іншага боку, не было істотнай розніцы ў памеры пухліны паміж групай экзасом, атрыманай з BV2, і кантрольнай групай пасля лячэння экзасомамі.Акрамя таго, мышы, якім ўводзілі клеткі глиомы і экзасомы, візуальна выявілі найбольшы аб'ём пухліны ў групе экзасом, атрыманых з BV2, заражаных RH (мал. 3C).Гэтыя вынікі дэманструюць, што інфікаваныя таксаплазмай экзасомы, атрыманыя з BV2, выклікаюць рост гліёмы ў мышынай мадэлі пухліны.
Анкагенез (AC) экзасом, атрыманых з BV2, у мадэлі ксенотрансплантата мышы U87.Памер пухліны (A) і вага (B) былі значна павялічаны ў голых мышэй BALB/c, якія атрымлівалі інфікаваныя RH экзасомы, атрыманыя з BV2.Голым мышам BALB/c (C) падскурна ўводзілі 1 х 107 клетак U87, суспензаваных у сумесі Matrigel.Праз шэсць дзён пасля ін'екцыі мышам апрацоўвалі 100 мкг экзасом, атрыманых з BV2.Памер і вага пухліны вымяраліся ў пазначаныя дні і пасля забівання адпаведна. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Дадзеныя паказалі, што 37 мікраРНК (16 з гіперэкспрэсіяй і 21 з паніжанай экспрэсіяй), звязаныя з імунітэтам або развіццём пухліны, былі значна зменены ў мікрагліі пасля заражэння штамам Toxoplasma RH (мал. 4A).Адносныя ўзроўні экспрэсіі miR-21 сярод змененых мікраРНК былі пацверджаны RT-PCR у рэальным часе ў экзасомах, атрыманых з BV2, экзасомах, апрацаваных клеткамі BV2 і U87.Экспрэсія мікраРНК-21 паказала значнае павелічэнне экзасом з клетак BV2, інфіцыраваных Toxoplasma gondii (штам RH) (мал. 4B).Адносныя ўзроўні экспрэсіі мікраРНК-21 у клетках BV2 і U87 павялічыліся пасля паглынання змененых экзасом (мал. 4B).Адносныя ўзроўні экспрэсіі miR-21 у тканінах галаўнога мозгу пацыентаў з пухлінамі і мышэй, інфіцыраваных Toxoplasma gondii (штам ME49), былі вышэй, чым у кантрольных, адпаведна (мал. 4C).Гэтыя вынікі карэлююць з адрозненнямі паміж узроўнямі экспрэсіі прадказаных і пацверджаных мікраРНК in vitro і in vivo.
Змены ў экспрэсіі экзасомальных miP-21a-5p у мікрагліі, заражанай Toxoplasma gondii (RH).(A) Дэманструе значныя змены ў siRNA, звязаныя з імунітэтам або развіццём пухліны пасля інфекцыі T. gondii RH.(B) Адносныя ўзроўні экспрэсіі miR-21 былі выяўлены з дапамогай RT-PCR у рэальным часе ў экзасомах, атрыманых з BV2, экзасомах, апрацаваных BV2, і клетках U87.(C) Адносныя ўзроўні экспрэсіі miR-21 былі знойдзены ў тканінах мозгу пацыентаў з пухлінамі (N=3) і мышэй, заражаных Toxoplasma gondii (штам ME49) (N=3). *P <0,05 было атрымана з дапамогай крытэрыю Сцьюдэнта. *P <0,05 было атрымана з дапамогай крытэрыю Сцьюдэнта. *P < 0,05 было атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцюдэнта. *P <0,05 было атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцьюдэнта. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, атрыманы з дапамогай t-крытэрыю Сцюдэнта. * P <0,05 атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцьюдэнта.
Экзосомы з RH-інфікаваных клетак BV2 прывялі да росту глиом in vivo і in vitro (мал. 2, 3).Каб выявіць адпаведныя мРНК, мы даследавалі ўзроўні мРНК проціпухлінных генаў-мішэняў, вілачнай скрынкі O1 (FoxO1), PTEN і запраграмаванай клеткавай смерці 4 (PDCD4) у клетках U87, заражаных экзасомамі, атрыманымі з BV2 або RH BV2.Біяінфарматычны аналіз паказаў, што некалькі генаў, звязаных з пухлінай, у тым ліку гены FoxO1, PTEN і PDCD4, маюць сайты звязвання miR-2121,22.Узроўні мРНК супрацьпухлінных генаў-мішэняў былі зніжаны ў экзасомах, атрыманых з BV2, у параўнанні з экзасомамі, атрыманымі з BV2 (мал. 5А).FoxO1 паказаў зніжэнне ўзроўню бялку ў экзасомах, атрыманых з BV2, заражаных RH, у параўнанні з экзасомамі, атрыманымі з BV2 (малюнак 5B).Грунтуючыся на гэтых выніках, мы маглі б пацвердзіць, што экзасомы, атрыманыя з інфікаванага RH BV2, паніжаюць рэгуляцыю антионкогенных генаў, захоўваючы сваю ролю ў росце пухліны.
Toxoplasma RH-інфікаваныя BV2-вытворныя экзасомы выклікаюць падаўленне проціпухлінных генаў у клетках глиомы U87 Toxoplasma RH-інфікаваныя BV2-вытворныя экзасомы.(A) ПЦР у рэжыме рэальнага часу экспрэсіі FoxO1, PTEN і PDCD4 у экзасомах, атрыманых з T. gondii RH-інфікаванага BV2, у параўнанні з экзасомамі PBS.мРНК β-актыну выкарыстоўвалі ў якасці кантролю.(B) FoxO1 выраз вызначалі Вестэрн-блоттинг і дадзеныя денситометрии былі статыстычна ацэнены з дапамогай праграмы ImageJ. *P <0,05 было атрымана з дапамогай крытэрыю Сцьюдэнта. *P <0,05 было атрымана з дапамогай крытэрыю Сцьюдэнта. *P < 0,05 было атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцюдэнта. *P <0,05 было атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцьюдэнта. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, атрыманы з дапамогай t-крытэрыю Сцюдэнта. * P <0,05 атрымана з дапамогай t-крытэрыю Сцьюдэнта.
Каб зразумець уплыў miP-21 у экзасомах на асацыяваную з пухлінай генную рэгуляцыю, клеткі U87 трансфікавалі інгібітарам miP-21 з выкарыстаннем Lipofectamine 2000 і клеткі збіралі праз 24 гадзіны пасля трансфекцыі.Узроўні экспрэсіі FoxO1 і p27 у клетках, трансфікаваных інгібітарамі miR-21, параўноўвалі з клеткамі, апрацаванымі экзасомамі, атрыманымі з BV2, з дапамогай QRT-PCR (мал. 6A, B).Трансфекцыя інгібітару miR-21 у клеткі U87 істотна зніжала рэгуляцыю экспрэсіі FoxO1 і p27 (мал. 6).
Інфікаваны RH экзасомальны miP-21, атрыманы з BV2, змяніў экспрэсію FoxO1/p27 у клетках глиомы U87.Клеткі U87 трансфікавалі інгібітарам miP-21 з выкарыстаннем липофектамина 2000 і клеткі збіралі праз 24 гадзіны пасля трансфекцыі.Узроўні экспрэсіі FoxO1 і p27 у клетках, трансфікаваных інгібітарамі miR-21, параўноўвалі з узроўнем у клетках, апрацаваных экзасомамі, атрыманымі з BV2, з дапамогай qRT-PCR (A, B).
Каб пазбегнуць імуннай рэакцыі гаспадара, паразіт таксаплазма трансфармуецца ў тканкавую цысту.Яны паразітуюць у розных тканінах, уключаючы галаўны мозг, сэрца і шкілетныя мышцы, на працягу ўсяго жыцця гаспадара і мадулююць імунны адказ гаспадара.Акрамя таго, яны могуць рэгуляваць клеткавы цыкл і апоптоз клетак гаспадара, спрыяючы іх праліферацыі14,24.Toxoplasma gondii пераважна заражае дендрытныя клеткі гаспадара, нейтрофілы і лінію манацытаў/макрафагаў, уключаючы мікраглію мозгу.Toxoplasma gondii індукуе дыферэнцыявання макрофагов фенатыпу М2, уплывае на гаенне ран пасля інфікавання ўзбуджальнікам, а таксама звязаны з гиперваскуляризацией і гранулематозным фіброз.Гэты паводніцкі патагенез токсоплазмозной інфекцыі можа быць звязаны з маркерамі, звязанымі з развіццём пухліны.Варожае асяроддзе, якое рэгулюецца токсоплазма, можа нагадваць адпаведны предрак.Такім чынам, можна меркаваць, што токсоплазменная інфекцыя павінна спрыяць развіццю пухлін галаўнога мозгу.Фактычна, высокія паказчыкі токсоплазмозной інфекцыі былі адзначаны ў сыроватцы крыві пацыентаў з рознымі пухлінамі галаўнога мозгу.Акрамя таго, Toxoplasma gondii можа быць яшчэ адным канцэрагенным эфектам і дзейнічае сінэргічна, каб дапамагчы іншым інфекцыйным канцерогенам развіць пухліны галаўнога мозгу.У сувязі з гэтым варта адзначыць, што P. falciparum і вірус Эпштэйна-Барра сінэргічны спрыяюць адукацыі лимфомы Беркитта.
Роля экзасом як рэгулятараў у галіне даследаванняў рака была шырока даследавана.Аднак роля экзасом паміж паразітамі і заражанымі гаспадарамі застаецца недастаткова вывучанай.Да гэтага часу розныя рэгулятары, уключаючы сакрэтаваныя вавёркі, тлумачаць біялагічныя працэсы, з дапамогай якіх найпростыя паразіты супрацьстаяць нападам гаспадара і ўвекавечваюць інфекцыю.У апошні час расце канцэпцыя таго, што мікравезікулы, звязаныя з найпростымі, і іх мікраРНК узаемадзейнічаюць з клеткамі гаспадара, ствараючы спрыяльнае асяроддзе для іх выжывання.Такім чынам, неабходныя далейшыя даследаванні, каб выявіць сувязь паміж змененымі экзасомальнымі мікраРНК і праліферацыяй клетак глиомы.Змена мікраРНК (кластарныя гены miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 і miR-17-92) звязваецца з прамоўтэрам STAT3 у макрафагах чалавека, інфіцыраваных таксаплазмай, рэгулюецца і індукуе анты -апоптоз ў адказ на інфекцыю Toxoplasma gondii 29.Таксаплазменная інфекцыя павялічвае экспрэсію miR-17-5p і miR-106b-5p, якія звязаны з некалькімі гиперпролиферативными захворваннямі 30 .Гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што мікраРНК гаспадара, якія рэгулююцца інфекцыяй таксаплазмы, з'яўляюцца важнымі малекуламі для выжывання паразітаў і патагенезу біялагічных паводзін гаспадара.
Змененыя мікраРНК могуць уплываць на розныя тыпы паводзін падчас ініцыяцыі і прагрэсавання злаякасных клетак, у тым ліку глиомы: самадастатковасць сігналаў росту, неадчувальнасць да сігналаў, якія інгібіруюць рост, ухіленне ад апоптозу, неабмежаваны рэплікатыўны патэнцыял, ангіягенез, інвазія і метастазы, а таксама запаленне.У глиоме змененыя мікраРНК былі выяўлены ў некалькіх даследаваннях прафілявання экспрэсіі.
У дадзеным даследаванні мы пацвердзілі высокі ўзровень экспрэсіі микроРНК-21 у інфіцыраваных таксаплазмай клетках гаспадара.miR-21 была ідэнтыфікавана як адна з мікраРНК з найбольш частай гіперэкспрэсіяй у салідных пухлінах, уключаючы глиомы, 33 і яе экспрэсія карэлюе са ступенню глиомы.Назапашаныя дадзеныя сведчаць аб тым, што miR-21 - гэта новы анкаген, які дзейнічае як антыапоптозны фактар ​​росту гліёмы і моцна экспрэсаваны ў тканінах і плазме злаякасных пухлін мозгу чалавека.Цікава, што інактывацыя miR-21 у клетках і тканінах глиомы выклікае інгібіраванне праліферацыі клетак з-за каспазазалежнага апоптозу.Біяінфарматычны аналіз прадказаных мішэняў miR-21 выявіў некалькі генаў-супрэсараў пухліны, звязаных з шляхамі апоптозу, у тым ліку запраграмаваную гібель клетак 4 (PDCD4), трапаміязін (TPM1), PTEN і вілачную скрынку O1 (FoxO1), з сайтам звязвання miR-2121..22.38.
FoxO1, як адзін з фактараў транскрыпцыі (FoxO), удзельнічае ў развіцці розных відаў рака чалавека і можа рэгуляваць экспрэсію генаў-супрессоров пухлін, такіх як p21, p27, Bim і FasL40.FoxO1 можа звязваць і актываваць інгібітары клеткавага цыклу, такія як р27, для падаўлення росту клетак.Больш за тое, FoxO1 з'яўляецца ключавым эфектарам сігналізацыі PI3K/Akt і рэгулюе многія біялагічныя працэсы, такія як прагрэсаванне клеткавага цыклу і дыферэнцыяцыя клетак праз актывацыю транскрыпцыі p2742.
У заключэнне, мы лічым, што экзасомальная міР-21, атрыманая з інфікаванай таксаплазмай мікрагліі, можа гуляць важную ролю ў якасці рэгулятара росту клетак глиомы (мал. 7).Аднак неабходныя далейшыя даследаванні, каб знайсці прамую сувязь паміж экзасомальнай міР-21, змененай інфекцыяй таксаплазмы і ростам гліёмы.Чакаецца, што гэтыя вынікі стануць адпраўной кропкай для вывучэння ўзаемасувязі паміж інфекцыяй таксаплазма і частатой глиомы.
У гэтым даследаванні прапануецца схематычная схема механізму канцерогенеза глиомы (галаўнога мозгу).Аўтар малюе ў PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Усе эксперыментальныя пратаколы ў гэтым даследаванні, уключаючы выкарыстанне жывёл, адпавядалі стандартным этычным рэкамендацыям Камітэта па доглядзе за жывёламі і карыстальнікам Сеульскага нацыянальнага ўніверсітэта і былі зацверджаны Інстытуцыйным аглядальным саветам медыцынскай школы Сеульскага нацыянальнага ўніверсітэта (нумар IRB SNU- 150715).-2).Усе эксперыментальныя працэдуры праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі ARRIVE.
Клеткі мікрагліі мышы BV2 і клеткі глиомы чалавека U87 культывавалі ў мадыфікаванай асяроддзі Дульбека Ігла (DMEM; Welgene, Сеул, Карэя) і асяроддзі Мемарыяльнага інстытута Розуэл Парк (RPMI; Welgene), адпаведна, кожная з якіх утрымлівала 10% фетальнай бычынай сыроваткі, 4 мМ л- глютамінам, 0,2 мМ пеніцыліну і 0,05 мМ стрэптаміцын.Клеткі культывавалі ў інкубатары з 5% CO2 пры 37°C.Іншая лінія клетак глиомы, U118, выкарыстоўвалася для параўнання з клеткамі U87.
Каб вылучыць экзасомы з інфікаваных T. gondii штамаў RH і ME49, тахізаіты T. gondii (штам RH) збіралі з брушнай паражніны 6-тыднёвых мышэй BALB/c, якім ін'екцыю ўводзілі за 3-4 дні да гэтага.Тахизоиты прамывалі тры разы PBS і ачышчалі цэнтрыфугаваннем у 40% Percoll (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША)43.Для атрымання тахизоитов штаму ME49 мышам BALB/c ўнутрыбрушна ўводзілі 20 тканкавых цыст і збіралі трансфармацыю тахизоитов ў цысты шляхам прамывання брушной поласці на 6-8-ы дзень пасля заражэння (ПІ).Мышы, заражаныя PBS.Тахізаіты ME49 вырошчвалі ў клетках з дадаткам 100 мкг/мл пеніцыліну (Gibco/BRL, Гранд-Айлэнд, штат Нью-Ёрк, ЗША), 100 мкг/мл стрэптаміцыну (Gibco/BRL) і 5% фетальнай бычынай сыроваткі (Lonza, Walkersville, MD) .., ЗША) пры 37 °C і 5% вуглякіслага газу.Пасля культывавання ў клетках Vero тахізаіты ME49 двойчы прапускалі праз іголку 25 калібра, а затым праз фільтр 5 мкм для выдалення смецця і клетак.Пасля прамывання тахизоиты ресуспендировали ў PBS44.Тканкавыя цысты штаму ME49 Toxoplasma gondii падтрымлівалі ўнутрыбрушнай ін'екцыяй цыст, выдзеленых з мозгу інфіцыраваных мышэй C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Соннам, Карэя).Мозг мышэй, інфіцыраваных ME49, збіралі пасля 3 месяцаў PI і здрабнялі пад мікраскопам для ізаляцыі цыст.Інфікаваных мышэй утрымлівалі ў спецыяльных свабодных ад патагенных мікраарганізмаў умовах (SPF) у Школе медыцыны Сеульскага нацыянальнага універсітэта.
Агульную РНК экстрагавалі з экзасом, атрыманых з BV2, клетак і тканін BV2, з дапамогай міні-набору miRNeasy (Qiagen, Hilden, Германія) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы, уключаючы час інкубацыі для этапу элюцыі.Канцэнтрацыю РНК вызначалі на спектрафатометры NanoDrop 2000.Якасць мікрачыпаў РНК ацэньвалі з дапамогай біяаналізатара Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Нідэрланды).
DMEM з 10% FBS, бедным экзасомамі, рыхтавалі ультрацэнтрыфугаваннем пры 100 000g на працягу 16 гадзін пры 4°C і фільтравалі праз фільтр 0,22 мкм (Nalgene, Рочэстэр, Нью-Ёрк, ЗША).Клеткі BV2, 5 × 105, культывавалі ў DMEM, якая змяшчае 10% FBS з знясіленнем экзасом і 1% антыбіётыкаў пры 37 ° C і 5% CO2.Пасля 24 гадзін інкубацыі тахізаіты штаму RH або ME49 (MOI = 10) былі дададзены ў клеткі, і неінвазійныя паразіты былі выдалены на працягу гадзіны і зноў напоўнены DMEM.Экзасомы з клетак BV2 былі вылучаныя з дапамогай мадыфікаванага дыферэнцыяльнага цэнтрыфугавання, найбольш шырока выкарыстоўванага метаду.Рэсуспендуйце асадак экзасомы ў 300 мкл PBS для аналізу РНК або бялку.Канцэнтрацыю ізаляваных экзасом вызначалі з дапамогай набору для аналізу бялку BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) і спектрафатометра NanoDrop 2000.
Ападкі з клетак BV2 або экзасомы, атрыманыя з BV2, лізіравалі ў растворы для экстракцыі бялку PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Соннам, Карэя), і вавёркі загружалі на афарбаваныя кумасі брыльянтавым сінім 10% поліакрыламідныя гелі SDS.Акрамя таго, вавёркі пераносілі на мембраны PVDF на працягу 2 гадзін.Вестэрн-блоты былі правераны з выкарыстаннем антыцелаў Alix (Cell Signaling Technology, Беверлі, Масачусэтс, ЗША) у якасці экзасомальнага маркера.HRP-кан'югаваны казіны анты-мышыны IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Мантгомеры, штат Тэхас, ЗША) і LAS-1000 plus люмінесцэнтны аналізатар выявы (Fuji Photographic Film, Токіо, Японія) выкарыстоўваліся ў якасці другасных антыцелаў..Для вывучэння памеру і марфалогіі экзасом была праведзена трансмісійная электронная мікраскапія.Экзасомы, вылучаныя з клетак BV2 (6,40 мкг/мкл), рыхтавалі на сетках, пакрытых вугляродам, і негатыўна афарбоўвалі 2% уранілацэтату на працягу 1 хвіліны.Падрыхтаваныя ўзоры назіралі пры паскаральным напрузе 80 кВ з дапамогай JEOL 1200-EX II (Токіо, Японія), абсталяванага ПЗС-камерай ES1000W Erlangshen (Гатан, Плезантон, Каліфорнія, ЗША).
Экзасомы, атрыманыя з BV2, афарбоўвалі з дапамогай чырвонага флуарэсцэнтнага лінкернага набору PKH26 (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) на працягу 15 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Клеткі U87, 2×105, з экзасомамі, пазначанымі PKH26 (чырвоным) або без экзасом у якасці адмоўнага кантролю, інкубавалі пры 37°C на працягу 24 гадзін у інкубатары з 5% CO2.Ядра клетак U87 афарбоўвалі DAPI (сінім), клеткі U87 фіксавалі ў 4% парафармальдэгіду на працягу 15 хвілін пры 4°C, а затым аналізавалі ў сістэме канфакальнага мікраскопа Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Мангейм, Германія).назіраецца.
кДНК была сінтэзавана з міРНК з выкарыстаннем сінтэзу першай ланцуга міРНК Mir-X і набору для qRT-PCR SYBR (Takara Bio Inc., Сіга, Японія).Колькасная ПЦР у рэальным часе была праведзена з выкарыстаннем сістэмы выяўлення ПЦР у рэальным часе iQ5 (Bio-Rad, Hercules, Каліфорнія, ЗША) з выкарыстаннем праймераў і шаблонаў, змешаных з прэміксам SYBR.ДНК амплифицировали на працягу 40 цыклаў дэнатурацыі пры 95 ° С на працягу 15 с і адпалу пры 60 ° С на працягу 60 с.Дадзеныя кожнай рэакцыі ПЦР былі прааналізаваны з дапамогай модуля аналізу дадзеных праграмнага забеспячэння аптычнай сістэмы iQ™5 (Bio-Rad).Адносныя змены ў экспрэсіі генаў паміж выбранымі генамі-мішэнямі і β-акцін/миРНК (і U6) былі разлічаны з дапамогай метаду стандартнай крывой.Паслядоўнасці праймераў, якія выкарыстоўваюцца, паказаны ў табліцы 1.
3 х 104 клетак глиомы U87 пасеялі ў 96-лункавыя пласціны і змяшалі з экзасомамі, заражанымі таксаплазмай, атрыманымі з BV2 (50 мкг/мл), або экзасомамі без імпульсу, атрыманымі з BV2 (50 мкг/мл), у якасці кантролю праз 12, 18 і 36 гадзін. .Хуткасць праліферацыі клетак вызначалі з дапамогай камплекта для падліку клетак-8 (Dojindo, Кумамота, Японія) (дадатковыя малюнкі S1-S3) 46.
5-тыднёвых самак голых мышэй BALB/c набылі ў Orient Bio (Соннам-сі, Паўднёвая Карэя) і ўтрымлівалі паасобку ў стэрыльных клетках пры пакаёвай тэмпературы (22±2°C) і вільготнасці (45±15°C).%) пры пакаёвай тэмпературы (22±2°С) і вільготнасці (45±15%).12-гадзінны цыкл святла і 12-гадзінны цыкл цемры праводзіліся пад SPF (Цэнтр жывёл Медыцынскай школы Сеульскага нацыянальнага універсітэта).Мышэй выпадковым чынам падзялілі на тры групы па 5 мышэй у кожнай, і ўсім групам падскурна ўвялі 400 мл PBS, які змяшчае 1 х 107 клетак гліёмы U87 і BD Matrigel™ са зніжаным фактарам росту (BD Science, Маямі, штат Фларыда, ЗША).Праз шэсць дзён пасля ін'екцыі пухліны 200 мг экзасом, атрыманых з клетак BV2 (з/без інфекцыі Toxoplasma), былі ўведзены ў месца пухліны.Праз дваццаць два дні пасля заражэння пухлінай памер пухліны мышэй у кожнай групе вымяралі штангенцыркулем тры разы на тыдзень, а аб'ём пухліны разлічвалі па формуле: 0,5×(шырыня)×2×даўжыня.
Аналіз экспрэсіі мікраРНК з выкарыстаннем масіва мікраРНК miRCURYTM LNA 7-га пакалення, масіваў mmu і rno (EXIQON, Vedbaek, Данія), які ахоплівае 1119 добра ахарактарызаваных мышэй сярод 3100 зондаў захопу мікраРНК чалавека, мышы і пацукі.У ходзе гэтай працэдуры ад 250 да 1000 нг агульнай РНК было выдалена з 5'-фасфату шляхам апрацоўкі шчолачнай фасфатазы кішачніка цяля з наступным пазначэннем зялёным флуарэсцэнтным фарбавальнікам Hy3.Затым пазначаныя ўзоры гібрыдызавалі шляхам загрузкі слайдаў з мікрачыпамі з выкарыстаннем камплекта камеры для гібрыдызацыі (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, ЗША) і камплекта для гібрыдызацыі слайдаў (Agilent Technologies).Гібрыдызацыю праводзілі на працягу 16 гадзін пры 56°С, затым мікрачыпы прамывалі ў адпаведнасці з рэкамендацыямі вытворцы.Затым апрацаваныя слайды мікрачыпаў былі адсканаваныя з дапамогай сістэмы сканавання мікрачыпаў Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Адсканаваныя выявы імпартаваліся з дапамогай праграмнага забеспячэння Agilent Feature Extraction версіі 10.7.3.1 (Agilent Technologies), а інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі кожнага малюнка была вызначана колькасна з дапамогай адпаведнага файла GAL мадыфікаванага пратакола Exiqon.Дадзеныя мікрачыпаў для бягучага даследавання захоўваюцца ў базе дадзеных GEO пад нумарам доступу GPL32397.
Профілі экспрэсіі спелых экзасомальных мікраРНК у мікрагліі штамаў RH або ME49, інфіцыраваных таксаплазмай, былі прааналізаваны з дапамогай розных сеткавых інструментаў.мікраРНК, звязаныя з развіццём пухліны, былі ідэнтыфікаваны з дапамогай miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) і адфільтраваны з нармалізаванай інтэнсіўнасцю сігналу (log2), большай за 8,0.Сярод мікраРНК было выяўлена, што дыферэнцыравана экспрэсіраваныя мікраРНК былі зменены больш чым у 1,5 разы пры аналізе фільтра мікраРНК, змененых штамамі RH або ME49, заражанымі T. gondii.
Клеткі высейваюць у шасцілункавыя пласціны (3 х 105 клетак/лунка) у opti-MEM (Gibco, Карлсбад, Каліфорнія, ЗША) з выкарыстаннем Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, ЗША).Трансфектаваныя клеткі культывавалі на працягу 6 гадзін, а затым асяроддзе змянялі на свежую поўную сераду.Клеткі збіралі праз 24 гадзіны пасля трансфекцыі.
Статыстычны аналіз у асноўным праводзіўся з выкарыстаннем t-крытэра Ст'юдэнта з праграмным забеспячэннем Excel (Microsoft, Вашынгтон, акруга Калумбія, ЗША).Для эксперыментальнага аналізу жывёл быў праведзены двухбаковы ANOVA з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ЗША). Р-значэння <0,05 лічыліся статыстычна значнымі. Р-значэння <0,05 лічыліся статыстычна значнымі. Значэнні P <0,05 лічыліся статыстычна значнымі. Значэнні Р <0,05 лічыліся статыстычна значнымі. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值<0,05 Значэнні P <0,05 лічыліся статыстычна значнымі. Значэнні Р <0,05 лічыліся статыстычна значнымі.
Усе эксперыментальныя пратаколы, выкарыстаныя ў гэтым даследаванні, былі зацверджаны Інстытуцыйным аглядным саветам Медыцынскай школы Сеульскага нацыянальнага універсітэта (нумар IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Ферлі, Дж. і інш.Прыблізная глабальная захваральнасць і смяротнасць ад раку ў 2018 годзе: крыніцы і метады GLOBOCAN.Інтэрпрэтацыя.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Рашыд, С., Рэман, К. і Акаш, М. С. Разуменне фактараў рызыкі пухлін галаўнога мозгу і іх тэрапеўтычных умяшанняў. Рашыд, С., Рэман, К. і Акаш, М. С. Разуменне фактараў рызыкі пухлін галаўнога мозгу і іх тэрапеўтычных умяшанняў.Рашыд, С., Рэман, К. і Акаш, MS Агляд фактараў рызыкі пухлін галаўнога мозгу і асноўных тэрапеўтычных умяшанняў. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Рашыд С., Рэман К. і Акаш М.С. Глыбокае разуменне фактараў рызыкі пухліны мозгу і тэрапеўтычных умяшанняў.Рашыд, С., Рэман, К. і Акаш, MS Агляд фактараў рызыкі пухлін галаўнога мозгу і асноўных тэрапеўтычных умяшанняў.Біямедыцынскія навукі.Фармацэўт.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактэрыяльна-вірусныя ўзаемадзеяння пры раку ротавай паражніны і жаночых палавых шляхоў чалавека: Рэзюмэ эпідэміялагічных і лабараторных дадзеных. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактэрыяльна-вірусныя ўзаемадзеяння пры раку ротавай паражніны і жаночых палавых шляхоў чалавека: Рэзюмэ эпідэміялагічных і лабараторных дадзеных.Kato I., Zhang J. і Sun J. Бактэрыяльна-вірусныя ўзаемадзеяння пры раку страўнікава-кішачнага гасцінца чалавека і жаночых палавых шляхоў: кароткі змест эпідэміялагічных і лабараторных дадзеных. Като, І., Чжан, Дж. і Сунь, Дж. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактэрыяльна-віруснае ўзаемадзеянне ў страваванні ротавай паражніны чалавека і жаночых рэпрадуктыўных шляхах: рэзюмэ папулярных навук аб хваробах і лабараторных дадзеных.Kato I., Zhang J. і Sun J. Бактэрыяльна-вірусныя ўзаемадзеяння пры раку страўнікава-кішачнага гасцінца чалавека і раку жаночых палавых органаў: кароткі змест эпідэміялагічных і лабараторных дадзеных.Рак 14, 425 (2022).
Магон, К. Л. і Пэрыш, Дж. Л. Ад інфекцыі да раку: як вірусы пухліны ДНК змяняюць цэнтральны вугляродны і ліпідны абмен клетак-гаспадароў. Магон, К. Л. і Пэрыш, Дж. Л. Ад інфекцыі да рака: як ДНК-вірусы пухліны змяняюць цэнтральны вугляродны і ліпідны абмен клетак гаспадара.Mahon, KL і Parish, JL Fire інфекцыя да раку: як на аснове ДНК опухолевые вірусы змяняюць цэнтральны вугляродны і ліпідны абмен клетак гаспадара. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：ДНК 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Магон, К. Л. і Пэрыш, Дж. Л. Ад інфекцыі да рака: як ДНК-вірусы пухліны змяняюць цэнтральны вугляродны і ліпідны абмен клетак гаспадара.Махон, К. Л. і Пэрыш, Дж. Л. Ад інфекцыі да раку: як ДНК-вірусы пухлін змяняюць цэнтральны метабалізм вугляроду і ліпідаў у клетках гаспадара.Адкрытая біялогія.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM і інш.Катехол эстрогены шистосомы і пячоначнай двуусткі і асацыяванага з гельмінтамі рака.пярэдні.горача ўнутры.5, 444 (2014).