Лямбліі дванаццаціперснай кішкі - гэта паразітычны арганізм, які выклікае лямбліёз, кішачную інфекцыю, асабліва распаўсюджаную ў маленькіх дзяцей з клінічнымі прыкметамі дыярэі.Раней мы паведамлялі, што пазаклеткавая G. duodenalis выклікае актывацыю нуклеатыдаў, якія звязваюць унутрыклеткавую алігамерызацыю, падобных на рэцэптар 3 (NLRP3), і рэгулюе запаленчыя рэакцыі гаспадара праз пазаклеткавую сакрэцыю бурбалак (EV).Аднак дакладныя малекулярныя заканамернасці асацыяванага з патагенам дуадэноккавага EV (GEV), які ўдзельнічае ў гэтым працэсе, і ролю инфламмасомы NLRP3 пры лямбліёзе яшчэ трэба высветліць.
Рэкамбінантныя эукарыётычныя экспрэсійныя плазміды pcDNA3.1(+)-альфа-2 і альфа-7.3 гіардыны ў GEV былі сканструяваны, трансфікаваны ў першасныя перытанеальныя макрафагі мышы і выяўлены шляхам вымярэння малекулы-мішэні запалення каспазы-1.Узровень экспрэсіі р20 быў правераны..G. duodenalis alpha-2 і alpha-7.3 giardines былі першапачаткова ідэнтыфікаваныя шляхам вымярэння інфламмасомы NLRP3 (NLRP3, праінтэрлейкіну-1 бэта [IL-1β], пракаспазы-1 і каспазы-1 p20), сакрэцыі IL.Узроўні 1β, ўзроўні алігамерызацыі апоптозного плямістага бялку (ASC) і імунафлюарэсцэнтная лакалізацыя NLRP3 і ASC.Ролю инфламмасомы NLRP3 у патагеннасці G. duodenalis затым ацэньвалі з выкарыстаннем мышэй, у якіх актывацыя NLRP3 была заблакаваная (мышы з блакаваннем NLRP3) і назіраліся паталагічныя змены масы цела, паразітарнай нагрузкі дванаццаціперснай кішкі і тканіны дванаццаціперснай кішкі.Акрамя таго, мы даследавалі, ці выклікаюць гиардины альфа-2 і альфа-7,3 сакрэцыю IL-1β in vivo праз инфламмасому NLRP3, і вызначылі ролю гэтых малекул у патагеннасці G. duodenalis ў мышэй.
Альфа-2 і альфа-7,3 гиардины індукуюць актывацыю инфламмасомы NLRP3 in vitro.Гэта прывяло да актывацыі p20 каспазы-1, павелічэнню ўзроўню экспрэсіі бялкоў NLRP3, pro-IL-1β і pro-caspase-1, значнаму павелічэнню сакрэцыі IL-1β, адукацыі плям ASA ў цытаплазме і індукцыі олигомеризации ASA.Запаленне NLRP3 Страта палавога члена ўзмацняе патагеннасць G. duodenalis у мышэй.У мышэй, якія атрымлівалі цысты праз зонд ад мышэй, заблакаваных NLRP3, выяўлена павелічэнне колькасці трофозоитов і сур'ёзныя пашкоджанні варсінак дванаццаціперснай кішкі, якія характарызуюцца некратычнымі крыптамі са зморшчанымі і разгалінаванымі.Эксперыменты in vivo паказалі, што giardines alpha-2 і alpha-7.3 могуць выклікаць сакрэцыю IL-1β праз інфламмасому NLRP3, а імунізацыя giardines альфа-2 і альфа-7.3 зніжала патагеннасць G. duodenalis у мышэй.
У сукупнасці вынікі гэтага даследавання паказваюць, што лямбліі альфа-2 і альфа-7.3 выклікаюць рэгуляцыю запалення NLRP3 гаспадара і зніжаюць інфекцыйнасць G. duodenalis у мышэй, якія з'яўляюцца перспектыўнымі мішэнямі для прафілактыкі лямбліёзу.
Giardia duodenum - пазаклеткавы найпросты паразіт, які жыве ў тонкім кішачніку і выклікае 280 мільёнаў выпадкаў лямбліёзу з дыярэяй штогод, асабліва сярод маленькіх дзяцей у краінах, якія развіваюцца [1].Людзі заражаюцца пры ўжыванні вады ці ежы, заражанай цыстамі M. duodenum, якія затым трапляюць у страўнік і вылучаюцца са страўнікавым сокам.Трофозоиты Giardia duodenum прымацоўваюцца да эпітэлія дванаццаціперснай кішкі, выклікаючы млоснасць, ваніты, дыярэю, болі ў жываце і страту вагі.Асобы з імунадэфіцытам і мукавісцыдозу успрымальныя да інфекцыі.Заражэнне таксама можа адбыцца пры аральным і анальным сэксе [2].Такія прэпараты, як метронідазол, тынідазол і нітазаксанід, з'яўляюцца пераважнымі варыянтамі лячэння дуадэнальных інфекцый [3].Аднак гэтыя хіміятэрапеўтычныя прэпараты выклікаюць неспрыяльныя пабочныя эфекты, такія як млоснасць, канцэрагенез і генатаксічнасць [4].Такім чынам, неабходна распрацаваць больш эфектыўныя стратэгіі для прадухілення інфекцыі G. duodenalis.
Інфламмасомы - гэта клас цытазольных бялковых комплексаў, якія з'яўляюцца часткай прыроджанага імуннага адказу, дапамагаючы абараніцца ад інвазіі патагенаў і апасродкаваць запаленчыя рэакцыі [5].Сярод гэтых інфламмасом актыўна вывучаецца інфламмасома, падобная на нуклеатыд-звязванне алігамерызацыі (NOD) рэцэптара 3 (NLRP3), нуклеатыд-звязвання алігамерызацыі (NLRP3), таму што яе можна выявіць па розных малекулярных структурах, звязаных з патагенамі/пашкоджаннямі (PAMP/ DAMP), распазнае, актывуе прыроджаную імунную сістэму.і рэгулюе гамеастаз кішачніка пры шматлікіх запаленчых захворваннях [6,7,8].Ён складаецца з рэцэптара распазнання вобразаў (PRR) NLRP3, адаптарнага апоптотического плямістага бялку (ASC) і эфектара пракаспазы-1 або пракаспазы-11.Інфламмасома NLRP3 дзейнічае як гаспадар супраць інвазіі патагенаў, як назіралася ў даследаваннях Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] і Leishmania.[11], але таксама паведамлялася, што актывацыя инфламмасомы NLRP3 абмяжоўвае ахоўныя імунныя рэакцыі і пагаршае прагрэсаванне захворвання, напрыклад, у глістоў [12].Грунтуючыся на нашых папярэдніх высновах, мы паведамілі, што пазаклеткавай G. duodenalis выклікае ўнутрыклеткавую актывацыю запалення NLRP3 і мадулюе запаленчыя рэакцыі гаспадара шляхам сакрэцыі пазаклеткавых бурбалак (EV) [13].Аднак ролю инфламмасомы NLRP3 у інфекцыі G. duodenalis in vivo яшчэ трэба будзе вызначыць.
Giardins былі першапачаткова апісаны як структурныя кампаненты цыташкілета G. duodenalis і гуляюць важную ролю ў рухомасці трофозоитов і прымацаванні эпітэліяльных клетак у тонкім кішачніку.Для лепшай адаптацыі да навакольнага асяроддзя і павышэння патагеннасці трофозоиты G. duodenalis развілі унікальную структуру цыташкілета, якая складаецца з 8 жгутиков, 1 сярэдняга цела і 1 вентрального дыска [14].Трофазоіты Giardia duodenum выкарыстоўваюць свой цыташкілет, каб пранікаць у верхнюю частку тонкай кішкі, асабліва ў дванаццаціперсную кішку, і прымацоўвацца да энтэрацытаў.Яны пастаянна мігруюць і прымацоўваюцца да эпітэліяльных клетак з дапамогай клеткавага метабалізму.Такім чынам, паміж іх цыташкілетам і вірулентнасцю існуе цесная ўзаемасувязь.Спецыфічныя для Giardia duodenum жыардыны з'яўляюцца кампанентамі структуры цыташкілета [15] і падзяляюцца на чатыры класы: α-, β-, γ- і δ-гіардыны.Ёсць 21 член сямейства α-giardin, усе з якіх маюць залежную ад кальцыя здольнасць звязваць фасфаліпіды [16].Яны таксама злучаюць цыташкілет з клеткавай мембранай.У людзей з дыярэяй, выкліканай G. duodenalis, α-гіардыны моцна выяўленыя і імунарэактыўныя падчас інфекцыі [17].Гетэралагічныя вакцыны на аснове лямблій альфа-1 абараняюць мышэй ад лямбліёз і з'яўляюцца патэнцыяльнымі антыгенамі-кандыдатамі для распрацоўкі вакцын [18].Альфа-8 гиардин, лакалізаваны ў плазматычнай мембране і жгутиках, але не ў вентральным дыску, узмацняе рухомасць і хуткасць росту трофозоитов у G. duodenalis [19].Альфа-14 гіардзіна прымацоўваецца да мікратрубачных структур на жгуціках і ўплывае на жыццяздольнасць G. duodenalis [20].Альфа-11 giardine прысутнічае ў багацці на працягу ўсяго жыццёвага цыклу, і празмерная экспрэсія альфа-11 giardine пашкоджвае сам G. duodenalis [21].Аднак незразумела, ці з'яўляюцца альфа-2 гіардзін і альфа-7.3 гіардзін ахоўнымі супраць інфекцыі G. duodenalis і механізмаў, якія ляжаць у іх аснове.
У гэтым даследаванні рэкамбінантныя эукарыятычныя экспрэсійныя плазміды pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine трансфектавалі ў першасныя перытанеальныя макрафагі мышы для актывацыі NLRP3 гаспадара.Затым былі праведзены скрынінг інфламмасомных мішэняў.Мы таксама ацанілі ролю инфламмасомы NLRP3 ў патагеннасці G. duodenalis, даследавалі, ці выклікаюць альфа-2 і альфа-7,3 гиардины актывацыю инфламмасомы NLRP3 in vivo, і вызначылі, што гэтыя дзве ролі гиардинов ў патагеннасці G. duodenalis.Нашай агульнай мэтай было распрацаваць перспектыўныя мэты для прафілактыкі інфекцыі G. duodenalis.
Самак мышэй дзікага тыпу (WT) C57BL/6 ва ўзросце 5-8 тыдняў былі набыты ў Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Ляанін, Кітай).Мышы мелі свабодны доступ да вады, атрымлівалі стэрылізаваную ежу і ўтрымліваліся ў 12/12-гадзінным цыкле святла/цемры.Перад заражэннем мышы атрымлівалі антыбіётыкі ad libitum у пітной вадзе з дадаткам ампіцыліну (1 мг/мл), ванкоміцын (1 мг/мл) і неоміцін (1,4 мг/мл) (усе набытыя ў Шанхаі, Кітай, штучныя арганізмы) [22]. ].].Мышэй, якія страцілі здольнасць есці і піць больш за 24 гадзін і страцілі ≥ 20% масы цела, усыпілі па-чалавечы шляхам вывіху шыйкі маткі.
WB G. duodenalis trophozoites (Амерыканская калекцыя тыпавых культур, Манассас, ЗША) былі дапоўнены 12,5% фетальнай бычынай сыроваткай (FBS; Every Green, Чжэцзян, Кітай) і 0,1% бычынай жоўцю (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ЗША). ).ЗША) у мікрааэробных умовах.Злітныя трофозоиты збіралі на лёд і пасіравалі ў суадносінах 1:4 для далейшага размнажэння.
Цысты лямблий дванаццаціперснай кішкі індукавалі, як апісана раней [23], трофозоиты збіралі ў лагарыфмічнай фазе, а затым разводзілі асяроддзем для інкапсуляцыі, рн 7,1 (мадыфікаваны TYI-S-33) да канчатковай канцэнтрацыі 1 × 106 трофозоитов/мл.канцэнтрацыя жоўці 0,05% сярэдняй).Трофозоиты культывавалі ў анаэробных умовах пры 37 ° С да лагарыфмічнай фазы росту.Мяняюць сераду на асяроддзе для індукцыі цыст (pH 7,8; ​​мадыфікаванае асяроддзе TYI-S-33 з 1% канцэнтрацыяй жоўці) і культывуюць G. duodenalis пры 37 ° С на працягу 48-96 гадзін, падчас якіх адукацыю цыст назіраюць пад мікраскопам.Пасля таго, як у большасці трофозоитов была выклікана адукацыя цыст, культуральная сумесь была сабрана і ресуспендирована ў стэрыльнай дэіянізаванай вадзе для лізісу астатніх трофозоитов.Цысты падлічвалі і захоўвалі пры 4°C для наступных аналізаў праз страўнікавы зонд у мышэй.
Пазаклеткавых бурбалак лямблий (GEVs) былі ўзбагачаны, як апісана раней [13].Трофазоіты ў лагарыфмічнай фазе росту ресуспендировали ў мадыфікаванай асяроддзі TYI-S-33, прыгатаванай з FBS з збедненым экзасомамі (Biological Industries, Бейт-Хаемек, Ізраіль) да канчатковай канцэнтрацыі 1 × 106 паразітаў/мл і інкубавалі на працягу 12 гадзін.вылучалі з супернатанта культуры цэнтрыфугаваннем пры 2000 g на працягу 10 мін, 10 000 g на працягу 45 мін і 100 000 g на працягу 60 мін.Ападкі растваралі ў фасфатным буферным растворы (PBS), колькасна вызначалі з дапамогай набору для аналізу бялку BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ЗША) і захоўвалі пры -80°C або выкарыстоўвалі непасрэдна для далейшых аналізаў.
Першасныя перытанеальнага макрофагов мышы былі падрыхтаваны, як апісана раней [24].Коратка, мышам (ва ўзросце 6-8 тыдняў) ўводзілі (нутрыбрюшинно [ip]) 2,5 мл 2,98% вадкай тиогликолевой асяроддзя Difco (BD, Franklin Lakes, Нью-Джэрсі, ЗША) і кармілі 3-4 неба.З брушнай паражніны мышэй пасля эўтаназіі збіралі завісь макрофагов і центрифугировали 3 разы пры 1000 g па 10 мін.Сабраныя клеткі выяўлялі з дапамогай праточнай цытаметрыі з выкарыстаннем маркера CD11b, пакуль чысціня клетак не была >98%, затым дадавалі ў 6-лункавыя пласціны для культуры клетак (4,5 х 106 клетак/лунку) і інкубавалі з 10% FBS (Bioindustry) пры 37°C.і 5% CO2.
РНК экстрагавалі з 1 × 107 трафазаітаў у 1 мл рэагента TRIzol (Vazyme, Nanjing, Кітай), геномную ДНК экстрагавалі з агульнай РНК G. duodenalis з выкарыстаннем MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Кітай) і сінтэзавалі камплементарную ДНК (кДНК). з дапамогай MonScript RTIIII Super Mix (Monad) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.
Інфармацыя аб паслядоўнасці CDS для мэтавага гена G. duodenalis была атрымана з NCBI GenBank.Выкарыстоўвайце Primer 5.0 для распрацоўкі пэўных бясшвовых праймераў кланавання для кожнага мэтавага гена.Прамы праймер (5′-3′) складаецца з трох частак: паслядоўнасці, якая перакрываецца, з лінеарызаваным вектарам pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) і стартавых кадонаў ATG і GNN (калі першая аснова не G).Гэта робіцца для павышэння эфектыўнасці выразы.Акрамя таго, па меншай меры, 16 пар асноваў (утрыманне GC 40–60%/Tm прыбл. 55 °C).Зваротны праймер (5'-3') складаецца з дзвюх частак, перакрываючайся паслядоўнасці з EcoRV-лінеарызаваным вектарам pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) і аб'яднанай асновы не менш за 16 п.н.(без апошніх двух прыпынкаў).асновы) кодон, напрыклад AA або GA, які дазваляе рэкамбінантным плазмідам экспрэсаваць пазначаныя вавёркі).Паслядоўнасці праймераў пералічаны ў табліцы 1 і былі сінтэзаваны кампаніяй Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Чанчунь, Кітай).
Мішэні амплифицировали з дапамогай ДНК-палімеразы Pfu (Tiangen, Пекін, Кітай) або Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекін, Кітай) з выкарыстаннем падрыхтаванай кДНК G. duodenalis у якасці шаблону.Эукарыятычны вектар экспрэсіі плазміда pcDNA3.1(+) была лінеарызавана ферментам рэстрыкцыі EcoRV і дэфасфарылявана з дапамогай Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Лінеарызаваныя фрагменты pcDNA3.1(+) і ампліфікаваныя фрагменты гена-мішэні ачышчалі з дапамогай набору для ачысткі геля ДНК (Tiangen) і колькасна вызначалі з дапамогай Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Фрагмент pcDNA3.1(+) і кожны фрагмент гена-мішэні былі рэкамбінаваны з выкарыстаннем сумесі для кланавання адзінай зборкі MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Сучжоу, Кітай) і пацверджаны секвенаваннем ДНК з дапамогай Comate Bioscience Company Limited (Чанчунь, Кітай)..
Плазміды без эндатаксінаў pcDNA3.1(+)-alpha-2 і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 былі атрыманы з выкарыстаннем міні-набору плазмід SanPrep без эндатаксінаў (Sangon Biotech).Канцэнтрацыя падтрымлівалася вышэй за 500 нг/мкл, каб гарантаваць, што ЭДТА ў буферы для элюіравання не перашкаджае аналізу трансфекцыі.Першасныя перытанеальныя макрафагі мышы культывавалі ў 6-лункавых пласцінах з поўнай асяроддзем RPMI 1640 (Biological Industries) на працягу 12 гадзін, затым клеткі прамывалі 3 разы ў цёплым PBS для выдалення пеніцыліну і стрэптаміцыну, а затым у асяроддзі, дапоўненай поўнай асяроддзем.Плазміды без эндатаксінаў pcDNA3.1(+)-alpha-2 і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 мкг) разводзілі ў 125 мкл асяроддзя Opti-MEM з адноўленай сыроваткай (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Затым 5 мкл рэагента для трансфекцыі Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) разводзяць у 125 мкл асяроддзя Opti-MEM з нізкім утрыманнем сыроваткі.Прыгатуйце комплексы ліпасома-ДНК, змяшаўшы разведзеную плазміду без эндатаксінаў з Lipofectamine 2000 і даўшы сумесі пастаяць пры пакаёвай тэмпературы на працягу 5 хвілін.Перанясіце комплексы асобна ў клеткі кожнай лункі і павольна змяшайце.Праз 4 гадзіны культуральную сераду клетак замянялі 2 мл поўнай асяроддзя RPMI 1640 і культываванне працягвалі 24 гадзіны.Да клетак дабаўлялі свежую сераду для культывавання клетак і інкубавалі ў розныя моманты часу ў залежнасці ад схемы аналізу.
Узоры бялку з супернатантов і клеткавых лизатов былі падрыхтаваны, як апісана раней [25].Параметры перадачы мембраны для пра-IL-1β, пра-каспазы-1, каспазы-1 p20, NLRP3, β-актыну і His-тэга былі 200 мА/90 мін.Для інтэрлейкіну 1β (IL-1β; R&D Systems, Мінеапаліс, Мінесота, ЗША), каспазы-1 (p20) (Adipogen, Швейцарыя) і NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Швейцарыя) і 1:5000, накіраваных на тэг His (Amylet Scientific, Ухань, Кітай) і β-акцін (Proteintech, Ухань, Кітай).
Сшыванне з disuccinimide suberate (DSS) было выканана, як апісана раней [26].Клеткі прамывалі 3 разы халодным PBS і цалкам лізіравалі іголкай 27 калібра ў 50 мкл рэакцыйнага буфера ASC (pH 8,0), які змяшчае 25 мм Na2PO4, 187,5 мм NaCl, 25 мм HEPES і 125 мм NaHCO3.Сумесь центрифугировали пры 5000 g на працягу 3 хвілін і асадак зашывалі 10 мкл DSS (25 ммоль у ДМСО) і 40 мкл рэакцыйнага буфера ASC на працягу 30 хвілін пры 37°C.Пасля цэнтрыфугавання пры 5000 g на працягу 10 хвілін асадак растваралі ў растворы з 40 мкл рэакцыйнага буфера ASC і 10 мкл буфера для загрузкі бялку 6x (TransGen, Пекін, Кітай), а затым раствор гасілі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 15 мін., Затым пракіпяціце 10 хвілін.Узоры бялку затым падвяргалі Вестэрн-блот з выкарыстаннем першасных антыцелаў супраць ASC (Wanleibio, Шэньян, Кітай) у суадносінах развядзення 1:500.
У адпаведнасці з раней апісанай працэдурай [13] збіралі супернатанты клетачнай культуры і вызначалі сакрэцыю провоспалительного цітокіны IL-1β з дапамогай набору ELISA мышынага IL-1 Beta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Пераўтварыце значэнні OD450nm у канцэнтрацыі бялку з дапамогай стандартнай крывой IL-1β.
Клеткі, нанесеныя на покрыўныя шкла, асцярожна прамывалі 3 разы ў цёплым PBS, фіксавалі ў фіксатары тканкавых клетак (Biosharp, Пекін, Кітай) на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы (RT), у 0,1% Triton X-Permeabilize пры 100 (разведзеным у PBS; Biosharp ) на працягу 20 хвілін пры пакаёвай тэмпературы і блакаваць у 5% сыроватачна альбуміна буйной рагатай жывёлы (у PBS) на працягу 2 гадзін пры пакаёвай тэмпературы.Затым клеткі інкубавалі на працягу ночы пры 4°C з першаснымі антыцеламі супраць ASC (развядзенне 1:100) або NLRP3 (развядзенне 1:100), адпаведна, і пазначанымі Cy3 казінымі анты-трусінымі IgG(H+L) (1:400; EarthOx , Сан-Францыска, Каліфорнія, ЗША) або FITC-кан'югаваны казіны анты-мышыны IgG (1:400; Earthox) на ноч пры 37°C у цемры на працягу 1 гадзіны.Ядра афарбоўвалі Hoechst 33258 (10 мкг/мл; UE, Сучжоу, Кітай) на працягу 5 хвілін і назіралі пад флуарэсцэнтным мікраскопам (Olympus Corporation, Токіо, Японія).
Мышэй падзялілі на чатыры групы (n = 7 у кожнай групе): (i) група адмоўнага кантролю, апрацаваная PBS (толькі PBS; праз зонд 100 мкл/мыш PBS з наступнай штодзённай внутрибрюшинной ін'екцыяй 100 мкл/мышы PBS праз 3 гадзіны)., бесперапынна на працягу 7 дзён);(ii) група адмоўнага кантролю, апрацаваная інгібітарам MCC950 [27] (100 мкл/мыш праз зонд з PBS, праз 3 гадзіны, 10 мг/кг масы цела [BW] MCC950 [у PBS] уводзілі ўнутрыбрушна штодня, працягласць 7 дзён);(iii) Група інфекцыі кісты G. duodenalis (1,5 х 106 цыст/мыш праз зонд, праз 3 гадзіны, 100 мкл/мыш унутрыбрюшинно штодня на працягу 7 дзён);(iv) Група камбінаванай інфекцыі кісты G. duodenalis Група лячэння інгібітарамі MCC950 (1,5 × 106 цыст/мыш праз зонд, 10 мг/кг масы цела MCC950 ўнутрыбрушна штодня на працягу 7 дзён праз 3 гадзіны).Масу цела кожнай мышы кантралявалі штодня, і ўсіх мышэй падвяргалі эўтаназіі на 7-ы дзень.Сабраную дванаццаціперсную кішку (даўжынёй 3 см) разразалі на невялікія кавалачкі ў 1 мл PBS, цысты знішчалі на ноч у PBS пры 4 ° C і трофозоиты G. duodenalis.Свежую дванаццаціперсную кішку (даўжынёй 1 см) вылучаюць для афарбоўвання гематоксилином і эозином (H&E).
Мышэй падзялілі на дзве групы: (i) кантрольную групу MOCK і (ii) групу інгібітараў MCC950.У кожнай групе было пяць метадаў лячэння (n = 7/групу лячэння): (i) група адмоўнага кантролю з PBS (толькі PBS; 100 мкл/мыш PBS, нутрацягліцавая (IM) ін'екцыя (пярэдняя большеберцовая цягліца) [28, 29] ;( ii) група адмоўнага кантролю плазміды pcDNA3.1(+) (100 мкг/ДНК мышы, праз нутрацягліцавыя ін'екцыі) (iii) група пазітыўнага кантролю з інфекцыяй кісты G. duodenalis (1,5 х 106 цыст/мыш, праз зонд) (iv) a); група, апрацаваная плазмідай pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 мкг/мыш ДНК, шляхам нутрацягліцавых ін'екцый), і (v) група, апрацаваная плазмідай pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 мкг/мыш) ДНК, пасля 12 гадзін пасажу мышы ў групе інгібітараў MCC950 атрымлівалі штодзённую внутрибрюшинную ін'екцыю MCC950 (10 мг/кг масы цела) на працягу 7 дзён, у той час як мышы ў групе MOCK атрымлівалі аднолькавы аб'ём лячэння PBS. Узоры крыві былі апрацаваны. Збіралі з вочных яблыкаў мышэй і пакідалі на ноч пры тэмпературы 4 °C. Узоры сыроваткі вылучалі з дапамогай імунаферментнага аналізу (ELISA) для вымярэнняў узроўняў IL-1β.
Трыццаць пяць мышэй падзялілі на пяць груп (n=7/група).Група 1 была групай адмоўнага кантролю, якую атрымлівалі PBS: мышы атрымлівалі 100 мкл PBS нутрацягліцава і праз 3 дні праз зонд.Група 2 - гэта група станоўчага кантролю, заражаная кістамі G. duodenalis: мышам ўводзілі 100 мкл PBS, а праз 3 дні ўнутрыстраўнікава ўводзілі 1,5 х 106 цыст/мыш.Трэцяя група - плазмидная імунізацыя pcDNA3.1(+) у спалучэнні з кантрольнай групай пры дуадэнальнай кісты: мышы атрымлівалі 100 мкг плазмидной ДНК pcDNA3.1(+)(im) перорально, 1,5×106 цыст/мыш 3 на працягу некалькіх дзён.Групы 4 і 5 складаліся з рэкамбінантнай плазміды pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або плазміды pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ў спалучэнні з інфекцыяй кісты G. duodenalis.Эксперыментальная група: мышы атрымалі 100 мкг pcDNA3.1(+)-giardine плазмидная ДНК (im), затым праз 3 дні, 1,5 × 106 цыст/мыш былі ўведзены праз зонд.Масу цела кожнай мышы кантралявалі пасля ўвядзення цысты G. duodenalis праз трубку.Свежую дванаццаціперсную кішку збіралі для вымярэння паразітарнай нагрузкі і аналізу афарбоўвання HE.
Гистопатологические змены былі прааналізаваны ў адпаведнасці з раней апублікаванай працэдурай [30].Свежую дванаццаціперсную кішку фіксавалі фіксатарам тканкавых клетак, залівалі ў парафін, разразалі на зрэзы памерам 4 мкм, афарбоўвалі H&E і аналізавалі пад светлавым мікраскопам.Рэпрэзентатыўныя паталагічныя змены ў сямі зрэзах тканін сямі незалежных мышэй былі ацэнены патолагаанатамам, якія не ведалі пра лячэнне, і былі зафіксаваны пры 200-кратным павелічэнні.Даўжыню варсінак і глыбіню крыпты вымяралі ў адпаведнасці з раней апісанымі метадамі.
Вынікі in vitro і in vivo былі атрыманы ў трох паўторах.Графікі былі створаны з дапамогай GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ЗША).Адрозненні паміж дзвюма групамі аналізавалі з дапамогай t-крытэра, а адрозненні паміж групамі ≥3 аналізавалі з дапамогай аднабаковага дысперсійнага аналізу (ANOVA) з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння SPSS (версія 22.0; SPSS IBM Corp., Армонк, Нью-Ёрк, ЗША).Дадзеныя былі прааналізаваны на аднастайнасць дысперсіі з выкарыстаннем тэсту Левена з наступным тэстам Бонфероні (B).Значнасць выяўляецца як Р<0,05, Р<0,01 і Р<0,001 (незначна [нс]) (Р>0,05).
Наш папярэдні аналіз пратэёмікі GEV у Кіёцкай энцыклапедыі генаў і геномаў (KEGG) паказаў, што многія мэты могуць удзельнічаць у актывацыі запаленчых сігнальных шляхоў [13].Мы выбралі дзве перспектыўныя мішэні, альфа-2 і альфа-7,3 гіардыны, амплифицируем гэтыя малекулы і выкарыстоўваем іх для пабудовы эукарыятычнага вектара экспрэсіі pcDNA3.1(+).Пасля секвенирования рэкамбінантныя экспрэсійныя плазміды pcDNA3.1(+)-alpha-2 і alpha-7.3 giardine трансфікавалі ў першасныя перытанеальныя макрафагі мышы, і быў ідэнтыфікаваны сігнатурны бялок запалення каспазы-1 p20 (фрагмент актываванай каспазы-1). як высвятленне ключавых малекул, якія могуць выклікаць запаленне.Вынікі паказалі, што альфа-2 і альфа-7.3 гіардыны могуць індукаваць экспрэсію p20 каспазы-1, аналагічную GEV.Не было выяўлена ніякага ўплыву на актывацыю каспазы-1 у неапрацаваным адмоўным кантролі (толькі PBS) і кантрольнай плазмідзе pcDNA3.1(+) (малюнак 1).
Вымярэнне актывацыі p20 каспазы-1 з дапамогай pcDNA3.1(+)-alpha-2 і alpha-7.3 giardins.Рэкамбінантныя эукарыятычныя экспрэсійныя плазміды pcDNA3.1(+)-альфа-2 і альфа-7.3 гіардыны (над кожнай дарожкай) трансфецыравалі ў першасныя перытанеальныя макрафагі мышы, а супернатанты культуры збіралі праз 24 гадзіны.Вестэрн-блот быў выкарыстаны для вымярэння ўзроўню экспрэсіі характэрнага бялку інфламмасомы каспазы-1 p20.Група лячэння толькі PBS (дарожка C) і група монотерапіі pcDNA3.1(+) (дарожка pcDNA3.1) выкарыстоўваліся ў якасці адмоўнага кантролю, а група лячэння GEV выкарыстоўвалася ў якасці станоўчага кантролю.Экспрэсія рэкамбінантнага бялку была пацверджана выяўленнем гістыдынавага тэга ў кожным бялку, і чаканымі бялковымі палосамі былі альфа-2 гіардзін (38,2 кДа) і альфа-7,3 гіардын (37,2 кДа).GEV, пазаклеткавыя бурбалкі Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-лінеарызаваны вектар, SUP, супернатант
Каб вызначыць, ці выклікаюць альфа-2 гіардзін і альфа-7.3 гіардзін экспрэсію p20 каспазы-1 і гуляюць ролю ў актывацыі запаленчага адказу NLRP3 гаспадара, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine і pcDNA3.1(+)-alpha -7,3 giardin быў трансфеціраваны ў першасныя перытанеальныя макрафагі мышы з дапамогай рэкамбінантнай плазмидной ДНК, і былі вызначаны ўзроўні экспрэсіі, лакалізацыі і алігамерызацыі ключавых запаленчых бялкоў NLRP3.У гэтым эксперыменце GEV выкарыстоўваўся ў якасці групы станоўчага кантролю, а група без лячэння (толькі PBS) або група лячэння трансфекцыяй pcDNA3.1(+) была адмоўнай групай.Вынікі паказалі, што, як і ў групе GEV, рэкамбінантная плазмідная ДНК giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 і giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 прывяла да павышэння рэгуляцыі NLRP3, pro-IL-1β і актывацыя прокаспазы-1 і каспазы-1 (мал. 2а).Акрамя таго, абедзве гіардзіны выклікалі значную сакрэцыю IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; альфа-2 гіардзін: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;альфа-7,3 гіардзін: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (малюнак 2b).Большасць бялкоў ASC былі манамернымі ў групе без лячэння або ў групе лячэння, трансфікаванай плазмідай pcDNA3.1(+), у адрозненне ад pcDNA3.1(+)-alpha-2 або pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 гіардзіны.Алігамерызацыя ASC адбылася ў рэкамбінантнай плазміднай ДНК групы або групы станоўчага кантролю GEV, дэманструючы алігамерную форму (малюнак 2c).Гэтыя папярэднія дадзеныя сведчаць аб тым, што альфа-2 гіардзін і альфа-7,3 гіардзін могуць выклікаць актывацыю запалення NLRP3.Наступныя імунафлюарэсцэнтныя даследаванні лакалізацыі ASC і NLRP3 паказалі, што ў групе адмоўнага кантролю бялок ASC быў раскіданы па ўсёй цытаплазме і з'яўляўся ў выглядзе кропкавага сігналу пры стымуляцыі pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.Група 1(+)-альфа-7,3 гіардзіну або станоўчая кантрольная група GEV (малюнак 2d).У групах адмоўнага кантролю і апрацаваных плазмідамі pcDNA 3.1 сігнал бялку NLRP3 не быў выяўлены, у той час як флуарэсцэнтны сігнал кропкі ў адказ на pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 быў выяўлены..giardine выяўляюцца ў цытаплазме або пры стымуляцыі HEV (мал. 2e).Гэтыя дадзеныя дадаткова дэманструюць, што G. duodenalis giardin alpha-2 і giardin alpha-7.3 актывуюць inflammasome NLRP3 у мышыных першасных макрафагах брушыны.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin актывуюць inflammasome NLRP3 у перытанеальных макрафагах мышэй.Трансфікуйце рэкамбінантныя эукарыётычныя экспрэсійныя плазміды pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin у першасныя перытанеальныя макрафагі і клеткі мышы або збярыце супернатант на працягу 24 гадзін для аналізу экспрэсіі, алігамерызацыі , сакрэцыя.і лакалізацыя ключавых запаленчых бялкоў.Група толькі PBS (C) і група апрацоўкі pcDNA3.1(+) выкарыстоўваліся ў якасці адмоўнага кантролю, а група апрацоўкі GEV выкарыстоўвалася ў якасці станоўчай групы.a Ключавыя запаленчыя вавёркі NLRP3, у тым ліку NLRP3, пра-IL-1β, пра-каспаза-1 і p20-каспаза-1, былі выяўлены з дапамогай Вестэрн-блот.b Узроўні сакрэцыі IL-1β у супернатантах вызначалі з дапамогай імунаферментнага аналізу (ELISA).Адрозненні паміж кантрольнай і эксперыментальнай групамі аналізавалі з дапамогай аднабаковага дысперсійнага аналізу (ANOVA) з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння SPSS версіі 22.0.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні паміж групамі **P<0,01 і ***P<0,001.c Узроўні алігамерызацыі ASC у гранулах вызначалі з дапамогай аналізу сшывання DSS, а ўзроўні ASC у клеткавых лізатах выкарыстоўвалі ў якасці кантролю загрузкі.d Візуалізацыя лакалізацыі ISC з дапамогай імунафлюарэсцэнцыі.e Імунафлюарэсцэнцыя выкарыстоўвалася для візуалізацыі лакалізацыі NLRP3.ASC, апоптотический плямісты бялок;IL, інтэрлейкіны;NLRP3, рэцэптар 3, падобны да алігамерызацыі, які звязвае нуклеатыд;ns, неістотна (P> 0,05)
І G. duodenalis, і GEV, якія ён вылучае, актывуюць інфламмасому NLRP3 і рэгулююць запаленчыя рэакцыі гаспадара in vitro.Такім чынам, роля инфламмасомы NLRP3 ў патагеннасці G. duodenalis застаецца няяснай.Каб даследаваць гэтую праблему, мы распрацавалі эксперымент паміж мышамі, інфіцыраванымі кістой G. duodenalis і мышамі, інфіцыраванымі кістой G. duodenalis + лячэнне інгібітарам MCC950, і параўналі экспрэсію інфламмасомы NLRP3 пры заражэнні кістой G. duodenalis.Падрабязная схема эксперыменту прадстаўлена на мал. 3а.Змены ў масе цела мышэй у розных групах лячэння назіралі на працягу 7 дзён пасля заражэння цыстамі, і вынікі паказаны на мал. 3b.У параўнанні з групай, апрацаванай чыстым PBS, вынікі паказалі, што (i) маса цела мышэй, заражаных кістой G. duodenalis, знізілася з 3-га па 7-ы дзень пасля заражэння;(II) апрацоўка інгібітарам MCC950 не мела істотнага ўплыву на масу цела мышэй..У параўнанні з групай з адной інфекцыяй, маса масы цела ў групе дуадэнальнай інфекцыі, якая атрымлівала MCC950, знізілася ў рознай ступені (дзень 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; дзень 2: ANOVA, F(3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001; Дзень 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Дзень 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; Дзень 5: ANOVA, F (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Дзень 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175; Дзень 7: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Гэтыя дадзеныя дэманструюць, што инфламмасома NLRP3 абараняе мышэй ад значнай страты вагі на ранніх стадыях (2-4 дні) дуадэнальнага інфекцыі.Затым мы імкнуліся выявіць трофозоиты G. duodenalis у прамыўнай вадкасці дванаццаціперснай кішкі, і вынікі паказаны на малюнку 3c.У параўнанні з групай інфекцыі кісты G. duodenalis колькасць трофозоитов ў дванаццаціперснай кішцы значна павялічылася пасля блакавання инфламмасомы NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Тканіны дванаццаціперснай кішкі, афарбаваныя HE, у параўнанні з адмоўным кантролем, апрацаваным толькі PBS і MCC950, паказалі: (i) інфекцыя кісты G. duodenalis прывяла да пашкоджання варсінак дванаццаціперснай кішкі (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) і атрафіі крыпты (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(II) дванаццаціперсная кішка мышэй, заражаных кістамі G. duodenalis і апрацаваных інгібітарамі MCC950.варсінкі дванаццаціперснай кішкі былі пашкоджаныя і мёртвыя (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) з атрафіяй і разгалінаваннем крыпты (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (мал. 3d- е) .Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што инфламмасома NLRP3 гуляе ролю ў зніжэнні патагеннасці G. duodenalis.
Роля инфламмасомы NLRP3 пры інфекцыі лямблий дванаццаціперснай кішкі.Мышам уводзілі праз зонд (внутрывенна) дуадэнакокавыя кісты, а затым атрымлівалі або без MCC950 (ip).У якасці кантролю выкарыстоўваліся асобныя групы лячэння PBS або MCC950.Доследная група і схема лячэння.b Масу цела мышэй у кожнай з розных груп лячэння кантралявалі на працягу 7 дзён.Розніца паміж групай інфекцыі G. duodenalis і групай лячэння інфекцыі G. duodenalis + MCC950 была прааналізавана з дапамогай t-тэсту з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння SPSS версіі 22.0.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні пры *P<0,05, **P<0,01 або ***P<0,001.c Паразітарная нагрузка вызначалася шляхам падліку колькасці трофозоитов у дуадэнальнага лаважа.Розніца паміж групай інфекцыі G. duodenalis і групай лячэння інфекцыі G. duodenalis + MCC950 была прааналізавана з дапамогай t-тэсту з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння SPSS версіі 22.0.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні пры *P <0,05.d Вынікі афарбоўвання гематаксілінам і эазінам (H&E) пры гістапаталогіі дванаццаціперснай кішкі.Чырвоныя стрэлкі паказваюць пашкоджанне варсінак, зялёныя - крыпты.Шкала: 100 мкм.e, f Статыстычны аналіз вышыні варсінак дванаццаціперснай кішкі і вышыні крыпты мышы.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні пры *P<0,05 і **P<0,01.Вынікі ўзяты з 7 незалежных біялагічных эксперыментаў.BW, маса цела;ig, внутрижелудочный шлях дастаўкі;ip, внутрибрюшинный шлях родаў;ns, нязначна (P> 0,05);PBS, фасфатны буферны раствор;WT, дзікі тып
Сэкрэцыя IL-1β з'яўляецца прыкметай актывацыі запалення.Для таго, каб вызначыць, ці G. duodenalis альфа-2 giardine і альфа-7.3 giardine актываваць NLRP3 гаспадара inflammasome ў натуральных умовах, мы выкарыстоўвалі неапрацаваных WT мышэй (фіктыўная група) і NLRP3 inflammasome заблакаваных мышэй (MCC950 інгібіруе група лячэння).Падрабязная схема эксперыменту прадстаўлена на мал. 4а.Эксперыментальныя групы складаліся з мышэй, якія атрымлівалі PBS, лячэнне кісты G. duodenalis праз зонд, нутрацягліцавыя ін'екцыі pcDNA3.1 і нутрацягліцавыя ін'екцыі pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.На 7-ы дзень пасля нутрацягліцавых ўвядзення рэкамбінантныя плазміды збіралі сыроватку крыві і вызначалі ўзровень IL-1β ў кожнай групе.Як паказана на малюнку 4b, у групе MOCK: (i) у параўнанні з групай PBS лячэнне pcDNA3.1 не мела істотнага ўплыву на сакрэцыю IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), аднак, Сэкрэцыя IL-β была значна павышана ў групе кіст G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine і pcDNA3.1- Нутрацягліцавыя ін'екцыі альфа-7.3 гиардина значна павялічылі сыроватачна ўзроўні IL-1β (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P <0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine індукаваў высокі ўзровень сакрэцыі IL -1β у групе нутрацягліцавых ін'екцый pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .У параўнанні з кожнай групай у групе лячэння MCC950 і групе MOCK: (i) узровень сакрэцыі IL-1β у кантрольнай групе PBS і кантрольнай групе pcDNA3.1 знізіўся да пэўнай ступені пасля блакіроўкі інгібітару MCC950, але розніцы не было значны (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) пасля блакіроўкі MCC950., сакрэцыя IL-1β была значна зніжана ў групе G. duodenalis, інфіцыраванай кістой, групе pcDNA3.1-alpha-2 giardine і pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine групе (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, Р = 0,0164).Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што альфа-2 гіардзін і альфа-7.3 гіардзін апасродкуюць актывацыю інфламмасомы NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines актывуе inflammasome гаспадара NLRP3 in vivo.Мышэй імунізавалі (IM) рэкамбінантнай эукарыётычнай экспрэсійнай плазмідай pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, а затым апрацоўвалі MCC950 (ip; група MCC950) або не (фіктыўная група) ).Група лячэння плазмідай PBS або pcDNA3.1(+) выкарыстоўвалася ў якасці адмоўнага кантролю, група лячэння кісты G. duodenalis выкарыстоўвалася ў якасці станоўчага кантролю.Доследная група і схема лячэння.b Сыроватачныя ўзроўні IL-1β у мышэй вымяралі на 7-ы дзень з дапамогай аналізу ELISA.Адрозненні паміж групамі ў групе MOCK аналізаваліся з дапамогай аднабаковага ANOVA, а адрозненні паміж групамі MOCK і групай MCC950 аналізаваліся з дапамогай t-тэсту праграмнага забеспячэння SPSS версіі 22.0.Зорачкі паказваюць на значныя адрозненні паміж групамі лячэння ў групе MOCK, *P<0,05 і ***P<0,001;Знакі даляра ($) паказваюць значныя адрозненні паміж кожнай групай у групе MOCK і групе MCC950 пры P <0,05.Вынікі сямі незалежных біялагічных эксперыментаў.i, нутрацягліцавыя ін'екцыі, ns, незначна (P> 0,05)
Каб даследаваць уплыў апасродкаванай альфа-2 і альфа-7,3 гиардином актывацыі inflammasome-гаспадара NLRP3 на інфекцыйнасць G. duodenalis, мы выкарыстоўвалі мышэй WT C57BL/6 і ўводзілі альфа-2 гиардин і альфа-7,3 гиардин.плазмиду ўводзілі нутрацягліцава, праз 3 сут праз страўнікавы зонд кісты G. duodenalis, пасля чаго за мышамі назіралі на працягу 7 сут.Падрабязная схема эксперыменту прадстаўлена на мал. 5а.Кожны дзень вымяралі масу цела кожнай мышы, на 7-ы дзень пасля ўвядзення праз страўнікавы зонд адбіралі ўзоры свежай тканіны дванаццаціперснай кішкі, вымяралі колькасць трофозоитов і назіралі гистопатологические змены.Як паказана на малюнку 5b, з павелічэннем часу кармлення маса цела мышэй у кожнай групе паступова павялічвалася.МТ мышэй пачынала зніжацца на 3-е суткі пасля внутрижелудочного ўвядзення цысты G. duodenalis, а затым паступова павялічвалася.Актывацыя інфламмасомы NLRP3, выкліканая нутрацягліцавай ін'екцыяй альфа-2 гіардыну і альфа7.3 гіардыну, значна аслабіла страту вагі ў мышэй (дзень 1: pcDNA3.1-alpha-2 гіардзін, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Дзень 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Дзень 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Дзень 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; Дзень 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Дзень 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; Дзень 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Дзень 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, Дзень 5: pcDNA3.1-alpha - 2 гіардзіны, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Дзень 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Дзень 6: pcDNA3 .1 - альфа-2 гіардзін, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Дзень 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Дзень 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Дзень 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Паразітарную нагрузку ацэньвалі ў дванаццаціперснай кішцы (мал. 5в).У параўнанні з неапрацаваным станоўчым кантролем і групай, якой уводзілі пусты вектар pcDNA3.1, колькасць трофозоитов G. duodenalis была значна зніжана ў групах, якім уводзілі α-2 гіардзін і α-7,3 жыардын (pcDNA3.1-alpha -2 гіардзін: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Акрамя таго, giardine альфа-7.3 быў больш ахоўны ў мышэй, чым giardine альфа-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Вынікі афарбоўвання ЁН паказаны на мал.5d–f.У мышэй, якім уводзілі альфа-2 гіардзін і альфа-7,3 гіардзін, было менш паражэнняў тканін дванаццаціперснай кішкі, якія выяўляліся пашкоджаннем варсінак, у параўнанні з мышамі, якім уводзілі G. duodenalis і мышамі, якім уводзілі G. duodenalis у спалучэнні з пустым вектарам pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 або P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 або P = 0,0055) і паменшаная атрафія крыпты (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 або P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 або P = 0,0191).Гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што альфа-2 гіардзін і альфа-7,3 гіардзін зніжаюць інфекцыйнасць G. duodenalis шляхам актывацыі inflammasome NLRP3 in vivo.
Роля pcDNA3.1(+)-giardins ў інфекцыі G. duodenalis.Мышэй імунізавалі (IM) рэкамбінантнымі эукарыятычнымі экспрэсійнымі плазмідамі pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, а затым заражалі цыстамі G. duodenalis (ig).Група PBS і група лячэння кісты дванаццаціперснай кішкі pcDNA3.1(+) выкарыстоўваліся ў якасці груп адмоўнага кантролю, а група лячэння кісты дванаццаціперснай кішкі выкарыстоўвалася ў якасці станоўчага кантролю.Доследная група і схема лячэння.b МТ мышэй у кожнай з розных груп лячэння кантралявалі на працягу 7 дзён пасля заражэння.Зорачкі паказваюць значныя адрозненні паміж групамі ў групе G. duodenalis і групе pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 і ***P <0,001;знак даляра ($) паказвае значную розніцу паміж кожнай групай G. duodenalis і групай pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 і $$$P<0,001.c Паразітарная нагрузка вызначалася шляхам падліку колькасці трофозоитов ў 1 мл дуадэнальнага лаважу з дванаццаціперснай кішкі (даўжынёй 3 см) і выяўлялася як колькасць паразітаў на см дванаццаціперснай кішкі.Адрозненні паміж групай інфекцыі G. duodenalis, групай pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine і групай pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine былі прааналізаваны з дапамогай аднабаковага ANOVA з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння SPSS версіі 22.0.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні пры **P<0,01 і ***P<0,001.г Гістопаталагічныя змены ў дванаццаціперснай кішцы.Чырвоныя стрэлкі паказваюць пашкоджанне варсінак, зялёныя - крыпты.Шкала: 100 мкм.e, f Статыстычны аналіз вышыні варсінак дванаццаціперснай кішкі мышы (e) і вышыні крыпты (f).Адрозненні паміж групамі на малюнку 1d былі прааналізаваны з дапамогай аднабаковага ANOVA з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння SPSS версіі 22.0.Зорачкі паказваюць істотныя адрозненні пры *P<0,05 і **P<0,01.Вынікі сямі незалежных біялагічных эксперыментаў.ns, неістотна (P> 0,05)
Giardia duodenum - добра вядомы кішачны паразіт чалавека і іншых млекакормячых, які выклікае лямбліёз.У 2004 годзе ён быў уключаны ў Ініцыятыву СААЗ па забытых захворваннях з-за яго высокай распаўсюджанасці на працягу 6 гадоў, асабліва ў супольнасцях з нізкім сацыяльна-эканамічным статусам [32].Прыроджаная імунная сістэма гуляе важную ролю ў імунным адказе на інфекцыю G. duodenalis.Паведамляецца, што мышыныя макрафагі паглынаюць і забіваюць G. duodenalis, вызваляючы пазаклеткавыя пасткі [33].Нашы папярэднія даследаванні паказалі, што G. duodenalis, неінвазіўны пазаклеткавы паразіт, актывуе запаленчыя сігнальныя шляхі p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 і NLRP3 у макрофагах мышэй для рэгулявання запаленчых рэакцый гаспадара, і вызвалены GEV можа ўзмацніць гэты працэс.13], 24].Аднак дакладныя PAMP, якія ўдзельнічаюць у рэгулюемым інфламмасомай NLRP3 запаленне пры GEV, і роля інфламмасомы NLRP3 пры лямбліёзе яшчэ трэба высветліць.Каб праліць святло на гэтыя два пытанні, мы правялі гэта даследаванне.
Інфламмасома NLRP3 знаходзіцца ў цытаплазме імунных клетак і можа актывавацца рознымі часціцамі, такімі як крышталі мачавой кіслаты, таксіны, бактэрыі, вірусы і паразіты.У бактэрыяльных даследаваннях таксіны былі вызначаны як ключавыя PAMP, якія актывуюць датчыкі запалення, што прыводзіць да запалення і гібелі клетак [34].Некаторыя структурна разнастайныя таксіны, такія як гемолизин залацістага стафілакока [35] і кішачнай палачкі [36], гемолизин BL (HBL) з энтеротоксина (NHE) [37], індукуюць актывацыю запалення NLRP3.Вірусныя даследаванні паказалі, што вірулентныя бялкі, такія як бялок абалонкі SARS-COV-2 (E) [38] і бялок NS5 віруса Зіка [39], з'яўляюцца важнымі PAMP, якія распазнаюцца рэцэптарам NLRP3.У даследаваннях паразітаў было паведамлена, што многія паразіты звязаны з актывацыяй інфламмасом гаспадара, напрыклад Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] і Leishmania [42].Вавёркі шчыльных гранул GRA35, GRA42 і GRA43, звязаныя з вірулентнасцю Toxoplasma gondii, неабходныя для індукцыі пироптоза ў макрофагов пацукоў Lewis [43].Акрамя таго, некаторыя даследаванні Leishmania сканцэнтраваны на асобных малекулах, якія ўдзельнічаюць у запаленні NLRP3, такіх як липофосфогликан мембраны паразіта [44] або металапратэаза цынку [45].Сярод аннексінападобных генаў сямейства альфа-гіардзінаў альфа-1 гіардзін быў патэнцыйным кандыдатам у вакцыну, які забяспечвае абарону ад G. duodenalis на мышынай мадэлі [18].У нашым даследаванні мы абралі фактары вірулентнасці G. duodenalis альфа-2 і альфа-7,3 giardine, якія з'яўляюцца ўнікальнымі для лямблий, але пра якія паведамляецца адносна менш.Гэтыя два гены-мішэні былі кланаваныя ў вектар эукарыятычнай сістэмы экспрэсіі pcDNA3.1(+) для аналізу актывацыі запалення.
У нашай мышынай мадэлі расшчэпленыя фрагменты каспазы служаць маркерамі запаленчай актывацыі.Пасля стымуляцыі NLRP3 узаемадзейнічае з ASC, набірае прокаспазы і генеруе актыўныя каспазы, якія расшчапляюць пра-IL-1β і pro-IL-18 да спелых IL-1β і IL-18 адпаведна -18.Запаленчыя каспазы (каспазы-1, -4, -5 і -11) - гэта кансерватыўнае сямейства цистеиновых пратэаз, якія маюць вырашальнае значэнне для прыроджанай абароны і ўдзельнічаюць у запаленні і запраграмаванай гібелі клетак [46].Каспаза-1 актывуецца кананічнымі инфламмасомами [47], у той час як каспазы-4, -5 і -11 расшчапляюцца падчас адукацыі атыповых инфламмасом [48].У гэтым даследаванні мы выкарыстоўвалі мышыныя макрафагі брушыны ў якасці мадэлі і даследавалі каспазу-1, расшчапленую p20 каспазай-1, у якасці маркера актывацыі запалення NLRP3 гаспадара ў даследаваннях інфекцыі G. duodenalis.Вынікі паказалі, што многія альфа-гіардыны адказваюць за тыповую актывацыю запалення, што супадае з адкрыццём ключавых вірулентных малекул, якія ўдзельнічаюць у бактэрыях і вірусах.Аднак наша даследаванне з'яўляецца толькі папярэднім экранам, і ёсць іншыя малекулы, якія могуць актываваць некласічныя инфламмасомы, так як наша папярэдняе даследаванне выявіла як класічныя, так і некласічныя инфламмасомы пры інфекцыі G. duodenalis [13].Для далейшага вызначэння таго, ці звязана створаная p20 каспаза-1 з інфламмасомай NLRP3, мы трансфектавалі альфа-2 і альфа-7.3 гіардыны ў перытанеальныя макрафагі мышы, каб вызначыць узровень экспрэсіі бялку ключавых малекул і ўзроўні алігамерызацыі ASC, пацвярджаючы, што абодва α-гіардыны актывуюцца inflammasome NLRP3.Нашы вынікі крыху адрозніваюцца ад вынікаў Manko-Pryhoda et al., якія паведамілі, што стымуляцыя клетак Caco-2 толькі штамамі G. muris або E. coli EPEC можа павялічыць інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі NLRP3, ASC і каспазы-1, хоць і не значна, у той час як кастымуляцыя G. muris і E. coli павялічвала ўзроўні трох бялкоў [49].Гэта разыходжанне можа быць звязана з адрозненнямі ў выбары відаў лямблій, клеткавых ліній і першасных клетак.Мы таксама правялі in vivo аналізы з выкарыстаннем MCC950 у 5-тыднёвых самак мышэй WT C57BL/6, якія больш успрымальныя да G. duodenalis.MCC950 - гэта магутны і селектыўны інгібітар NLRP3 з невялікімі малекуламі, які блакуе кананічную і некананічную актывацыю NLRP3 у нанамалярных канцэнтрацыях.MCC950 інгібіруе актывацыю NLRP3, але не ўплывае на актывацыю запаленчых шляхоў AIM2, NLRC4 і NLRP1 або сігнальных шляхоў TLR [27].MCC950 блакуе актывацыю NLRP3, але не інгібіруе ініцыяцыю NLRP3, адток K+, прыток Ca2+ або ўзаемадзеянне паміж NLRP3 і ASC;замест гэтага ён інгібіруе актывацыю инфламмасомы NLRP3, блакуючы олигомеризацию ASC [27].Такім чынам, мы выкарыстоўвалі MCC950 у даследаванні in vivo, каб вызначыць ролю инфламмасомы NLRP3 пасля ін'екцыі гиардина.Актываваная каспаза-1 p10 расшчапляе провоспалительные цітокіны пра-IL-1β і пра-IL-18 да спелых IL-1β і IL-18 [50].У гэтым даследаванні ўзроўні IL-1β ў сыроватцы крыві ў мышэй, якія атрымлівалі giardine з або без MCC950, выкарыстоўваліся ў якасці індыкатара таго, ці была актываваная инфламмасома NLRP3.Як і чакалася, лячэнне MCC950 значна знізіла ўзроўні IL-1β ў сыроватцы крыві.Гэтыя дадзеныя ясна дэманструюць, што G. duodenalis giardin alfa-2 і giardin alfa-7.3 здольныя актываваць мышыную инфламмасому NLRP3.
Значныя дадзеныя, назапашаныя за апошняе дзесяцігоддзе, паказалі, што IL-17A з'яўляецца галоўным рэгулятарам імунітэту супраць G. muris, індукуючы перадачу сігналаў IL-17RA, выпрацоўваючы антымікробныя пептыды і рэгулюючы актывацыю камлементу [51].Тым не менш, інфекцыя лямблій часцей сустракаецца ў маладых людзей, і было паведамлена, што інфекцыя лямблій у маладых мышэй не актывуе рэакцыю IL-17A для аказання свайго ахоўнага эфекту [52], што прымушае даследчыкаў шукаць іншыя імунамадулюючыя лямбліі.механізмы заражэння гельмінтамі.Аўтары нядаўняга даследавання паведамляюць, што G. muris можа актываваць інфламмасому NLRP3 E. coli EPEC, што спрыяе выпрацоўцы антымікробных пептыдаў і зніжае здольнасць да прымацавання і колькасць трафазаітаў у кішачным тракце, тым самым памяншаючы цяжар паразы тоўстай кішкі. хваробы, выкліканыя бацыламі [49].Инфламмасома NLRP3 удзельнічае ў развіцці розных захворванняў.Даследаванні паказалі, што сінегнойную палачка запускае аўтафагію ў макрофагов, каб пазбегнуць гібелі клетак, і гэты працэс залежыць ад актывацыі инфламмасомы NLRP3 [53].Для N. caninum апасродкаваная актыўнымі формамі кіслароду актывацыя инфламмасомы NLRP3 абмяжоўвае яе рэплікацыю ў гаспадара, што робіць яе патэнцыйнай тэрапеўтычнай мішэнню [9].Устаноўлена, што Paracoccidioides brasiliensis індукуе актывацыю інфламмасомы NLRP3 у дендрытных клетках касцявога мозгу мышэй, што прыводзіць да вызвалення запаленчага цітокіны IL-1β, які гуляе важную ролю ў абароне гаспадара [10].Некалькі відаў Leishmania, у тым ліку L. amazonensis, L. major, L. braziliensis і L. infantum chagasi, актывуюць NLRP3 і ASC-залежную каспазу-1 у макрафагах, а таксама інфекцыю Leishmania.Рэплікацыя паразіта ўзмацняецца ў мышэй з дэфіцытам гена NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Замбоні і інш.Паведамляецца, што інфекцыя лейшманіяй выклікае актывацыю інфламмасомы NLRP3 у макрафагах, што абмяжоўвае рэплікацыю ўнутрыклеткавага паразіта.Такім чынам, Leishmania можа інгібіраваць актывацыю NLRP3 як стратэгію пазбягання.У даследаваннях in vivo инфламмасома NLRP3 спрыяла элімінацыі Leishmania, але не ўплывала на тканіны [54].І наадварот, у даследаваннях гельмінтозу актывацыя инфламмасомы NLRP3 прыгнятала ахоўны імунітэт гаспадара супраць страўнікава-кішачнага гельмінтозу [12].Шыгела - адна з асноўных бактэрый, якія выклікаюць дыярэю ва ўсім свеце.Гэтыя бактэрыі могуць індукаваць выпрацоўку IL-1β праз апасродкаваны рэцэптарам P2X7 адток K+, актыўныя формы кіслароду, падкісленне лізасом і пашкоджанне мітахондрый.Инфламмасома NLRP3 адмоўна рэгулюе фагацытоз і бактэрыцыдную актыўнасць макрофагов супраць Shigella [55].Даследаванні Plasmodium паказалі, што мышы з дэфіцытам AIM2, NLRP3 або каспазы-1, заражаныя Plasmodium, вырабляюць высокія ўзроўні інтэрферону тыпу 1 і больш устойлівыя да інфекцыі Plasmodium [56].Аднак роля альфа-2 гіардыну і альфа-7.3 гіардыну ў індукцыі патагеннай актывацыі запалення NLRP3 у мышэй незразумелая.
У гэтым даследаванні інгібіраванне инфламмасомы NLRP3 з дапамогай MCC950 зніжала масу цела і павялічвала колькасць трофозоитов у прамыўной вадкасці кішачніка ў мышэй, што прывяло да больш сур'ёзных паталагічных змен у тканіны дванаццаціперснай кішкі.Альфа-2 гіардзін і альфа-7.3 гіардзін актывуюць запаленне NLRP3 мышы-гаспадара, павялічваюць масу цела мышы, памяншаюць колькасць трофозоитов у прамыўной вадкасці кішачніка і палягчаюць паталагічныя паразы дванаццаціперснай кішкі.Гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што G. duodenalis можа актываваць інфламмасому гаспадара NLRP3 праз альфа-2 і альфа-7,3 гіардзін, зніжаючы патагеннасць G. duodenalis у мышэй.
У сукупнасці нашы вынікі дэманструюць, што альфа-2 і альфа-7,3 гіардыны выклікаюць актывацыю інфламмасомы гаспадара NLRP3 і зніжаюць інфекцыйную здольнасць G. duodenalis у мышэй.Такім чынам, гэтыя малекулы з'яўляюцца перспектыўнымі мішэнямі для прафілактыкі лямбліёз.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Лян АКС, Лян ААМ, Хуан АХК, Сергі КМ, Кам ДжКМ.Лямбліёз: агляд.Нядаўна стала вядома, што ў Пэт Інфлам алергія на лекі.2019;13:134–43.
Эскобедо А. А., Цымерман С. Лямбліёз: агляд фармакатэрапіі.Экспертнае заключэнне фармацэўта.2007 год;8: 1885–902.
Цянь Хуафэн, Чэнь Бінь, Вэнь Цзяньфэн.Лямбліёз, лекавая ўстойлівасць і адкрыццё новых мішэняў.Заражае мэты наркотыкаў Disord.2010; 10: 295-302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T і інш. NLRP3 inflammasome і запаленчыя захворванні.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Роля инфламмасомы ў запаленні кішачніка і раку.Гастраэнтэралогіі.2011 год;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical і атыповая актывацыя inflammasome NLRP3 на скрыжаванні імуннай талерантнасці і запалення кішачніка.перадімунныя.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S і інш.Апасродкаваная ROS актывацыя інфламмасомы NLRP3 удзельнічае ў адказ на інфекцыю N. caninum.Пераносчык паразітаў.2020; 13: 449.