Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Генныя вектары для лячэння мукавісцыдозу лёгкіх павінны быць накіраваны на праводзяць дыхальныя шляхі, паколькі перыферычная трансдукция лёгкіх не аказвае тэрапеўтычнага эфекту.Эфектыўнасць трансдукцыі віруса напрамую залежыць ад часу знаходжання носьбіта.Аднак вадкасці для дастаўкі, такія як носьбіты генаў, натуральным чынам дыфузіююць у альвеолы ​​падчас інгаляцыі, і лячэбныя часціцы любой формы хутка выдаляюцца з дапамогай мукоцилиарного транспарту.Падаўжэнне часу знаходжання носьбітаў генаў у дыхальных шляхах важна, але цяжка дасягнуць.Магнітныя часціцы, звязаныя з носьбітам, якія могуць быць накіраваны на паверхню дыхальных шляхоў, могуць палепшыць рэгіянальнае нацэльванне.З-за праблем з візуалізацыяй in vivo паводзіны такіх маленькіх магнітных часціц на паверхні дыхальных шляхоў у прысутнасці прыкладзенага магнітнага поля недастаткова вывучаны.Мэтай гэтага даследавання было выкарыстанне сінхротроннай візуалізацыі для візуалізацыі in vivo руху серыі магнітных часціц у трахеі пацукоў пад наркозам, каб вывучыць дынаміку і заканамернасці паводзін адзіночных і масавых часціц in vivo.Затым мы таксама ацанілі, ці павялічыць эфектыўнасць трансдукцыі ў трахеі пацукоў дастаўка лентивирусных магнітных часціц у прысутнасці магнітнага поля.Сінхратронны рэнтгенаўскі малюнак паказвае паводзіны магнітных часціц у нерухомых і рухомых магнітных палях in vitro і in vivo.Часціцы не могуць быць лёгка перацягнуты па паверхні жывых дыхальных шляхоў з дапамогай магнітаў, але падчас транспарціроўкі адклады канцэнтруюцца ў полі зроку, дзе магнітнае поле найбольш моцнае.Эфектыўнасць трансдукцыі таксама была павялічана ў шэсць разоў, калі лентывірусныя магнітныя часціцы дастаўляліся ў прысутнасці магнітнага поля.У сукупнасці гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што лентывірусныя магнітныя часціцы і магнітныя палі могуць быць каштоўнымі падыходамі для паляпшэння таргетынгу геннага вектара і ўзроўню трансдукцыі ў праводзяць дыхальных шляхах in vivo.
Мукавісцыдоз (МВ) выкліканы варыяцыямі ў адным гене, званым рэгулятарам трансмембраннай праводнасці (МВП).Бялок CFTR - гэта іённы канал, які прысутнічае ў многіх эпітэліяльных клетках па ўсім целе, уключаючы дыхальныя шляхі, галоўнае месца ў патагенезе мукавісцыдозу.Дэфекты CFTR прыводзяць да парушэння транспарту вады, дэгідратаціі паверхні дыхальных шляхоў і памяншэння глыбіні пласта вадкасці на паверхні дыхальных шляхоў (ASL).Гэта таксама пагаршае здольнасць сістэмы мукоцилиарного транспарту (MCT) ачышчаць дыхальныя шляхі ад удыхальных часціц і хваробатворных мікраарганізмаў.Наша мэта складаецца ў тым, каб распрацаваць генную тэрапію лентывірусам (LV), каб даставіць правільную копію гена CFTR і палепшыць ASL, MCT і здароўе лёгкіх, а таксама працягваць распрацоўку новых тэхналогій, якія могуць вымяраць гэтыя параметры in vivo1.
Вектары LV з'яўляюцца аднымі з вядучых кандыдатаў для геннай тэрапіі мукавісцыдозу, галоўным чынам таму, што яны могуць пастаянна інтэграваць тэрапеўтычны ген у базальныя клеткі дыхальных шляхоў (ствалавыя клеткі дыхальных шляхоў).Гэта важна, таму што яны могуць аднаўляць нармальную гідратацыю і ачышчэнне слізі шляхам дыферэнцыяцыі ў функцыянальныя клеткі паверхні дыхальных шляхоў з карэкцыяй генаў, звязаныя з мукавісцыдозам, што прыводзіць да карысці на працягу ўсяго жыцця.Вектары ЛЖ павінны быць накіраваны супраць праводзяць дыхальных шляхоў, так як менавіта тут пачынаецца паражэнне лёгкіх пры МВ.Дастаўка вектара глыбей у лёгкае можа прывесці да альвеалярнай трансдукцыі, але гэта не аказвае тэрапеўтычнага эфекту пры мукавісцыдозу.Аднак такія вадкасці, як носьбіты генаў, натуральным чынам мігруюць у альвеолы ​​пры ўдыханні пасля родаў3,4, і тэрапеўтычныя часціцы хутка выкідваюцца ў ротавую паражніну пры дапамозе MCT.Эфектыўнасць трансдукцыі ЛЖ напрамую залежыць ад часу, на працягу якога вектар застаецца побач з клеткамі-мішэнямі, каб забяспечыць клеткавы паглынанне - «час знаходжання» 5, які лёгка скарачаецца тыповым рэгіянальным паветраным патокам, а таксама скаардынаваным паглынаннем слізі і часціц MCT.Для мукавісцыдозу здольнасць падоўжыць час знаходжання ЛЖ у дыхальных шляхах важная для дасягнення высокага ўзроўню трансдукцыі ў гэтай галіне, але да гэтага часу была складанай задачай.
Каб пераадолець гэтую перашкоду, мы мяркуем, што магнітныя часціцы LV (MP) могуць дапамагчы двума ўзаемадапаўняльнымі спосабамі.Па-першае, іх можна накіроўваць магнітам да паверхні дыхальных шляхоў, каб палепшыць нацэльванне і дапамагчы часціцам-носьбітам генаў знаходзіцца ў патрэбнай вобласці дыхальных шляхоў;і ASL) перамяшчаюцца ў клетачны пласт 6. MP шырока выкарыстоўваюцца ў якасці мэтавых сродкаў дастаўкі лекаў, калі яны звязваюцца з антыцеламі, хіміятэрапеўтычнымі прэпаратамі або іншымі малымі малекуламі, якія прымацоўваюцца да клеткавых мембран або звязваюцца з адпаведнымі рэцэптарамі клетачнай паверхні і назапашваюцца ў месцах пухліны ў наяўнасць статычнага электрычнасці.Магнітныя палі для тэрапіі рака 7. Іншыя «гіпертэрмічныя» метады накіраваны на знішчэнне опухолевых клетак шляхам награвання МП пры ўздзеянні вагальных магнітных палёў.Прынцып магнітнай трансфекцыі, пры якой магнітнае поле выкарыстоўваецца ў якасці агента трансфекцыі для ўзмацнення пераносу ДНК у клеткі, звычайна выкарыстоўваецца in vitro з выкарыстаннем шэрагу невірусных і вірусных генных вектараў для клеткавых ліній, якія цяжка трансдуцыраваць ..Устаноўлена эфектыўнасць магнитотрансфекции ЛЖ з дастаўкай МП ЛЖ in vitro ў клеткавую лінію эпітэлія бронх чалавека ў прысутнасці статычнага магнітнага поля, якая павялічвае эфектыўнасць трансдукции ў 186 разоў у параўнанні з адным вектарам ЛЖ.МТ ЛЖ таксама прымянялася да мадэлі мукавісцыдозу in vitro, дзе магнітная трансфекцыя павялічвала трансдукцыю ЛЖ у культурах на падзеле паветра-вадкасць у 20 разоў у прысутнасці мокроты мукавісцыдозу10.Аднак магнітатрансфекцыі органаў in vivo надавалася адносна мала ўвагі і яна была ацэненая толькі ў некалькіх даследаваннях на жывёл11,12,13,14,15, асабліва ў лёгкіх16,17.Аднак магчымасці магнітнай трансфекцыі ў тэрапіі лёгкіх пры мукавісцыдозу відавочныя.Тан і інш.(2020) заявіў, што «праверачнае даследаванне эфектыўнай дастаўкі магнітных наначасціц у лёгкія адкрые шлях для будучых стратэгій інгаляцыі CFTR для паляпшэння клінічных вынікаў у пацыентаў з мукавісцыдозам»6.
Паводзіны дробных магнітных часціц на паверхні дыхальных шляхоў у прысутнасці прыкладзенага магнітнага поля цяжка візуалізаваць і вывучыць, і таму яны дрэнна вывучаны.У іншых даследаваннях мы распрацавалі метад фазавай кантраснай рэнтгенаўскай візуалізацыі на аснове сінхратроннага распаўсюджвання (PB-PCXI) для неінвазіўнай візуалізацыі і колькаснай ацэнкі драбнюткіх in vivo змяненняў глыбіні ASL18 і паводзін MCT1920 для непасрэднага вымярэння гідратацыі паверхні газавага канала і выкарыстоўваецца ў якасці ранняга паказчыка эфектыўнасці лячэння.Акрамя таго, наш метад ацэнкі MCT выкарыстоўвае часціцы дыяметрам 10–35 мкм, якія складаюцца з аксіду алюмінія або шкла з высокім паказчыкам праламлення, у якасці маркераў MCT, бачных з дапамогай PB-PCXI21.Абодва метады падыходзяць для візуалізацыі шэрагу тыпаў часціц, у тым ліку MP.
Дзякуючы высокаму прастораваму і часоваму раздзяленню нашы аналізы ASL і MCT на аснове PB-PCXI добра падыходзяць для вывучэння дынамікі і паводніцкіх мадэляў адзінкавых і аб'ёмных часціц in vivo, каб дапамагчы нам зразумець і аптымізаваць метады дастаўкі гена MP.Падыход, які мы выкарыстоўваем тут, заснаваны на нашых даследаваннях з выкарыстаннем прамянёвай лініі SPring-8 BL20B2, у якой мы візуалізавалі рух вадкасці пасля дастаўкі дозы фіктыўнага вектара ў насавыя і лёгачныя дыхальныя шляхі мышэй, каб дапамагчы растлумачыць нашы гетэрагенныя мадэлі экспрэсіі генаў, якія назіраюцца у нашым ген.даследаванні на жывёл з носьбітнай дозай 3,4 .
Мэтай гэтага даследавання было выкарыстанне сінхротрона PB-PCXI для візуалізацыі in vivo рухаў серыі MP у трахеі жывых пацукоў.Гэтыя даследаванні візуалізацыі PB-PCXI былі распрацаваны для праверкі серыі MP, напружанасці магнітнага поля і месцазнаходжання, каб вызначыць іх уплыў на рух MP.Мы выказалі здагадку, што знешняе магнітнае поле дапаможа дастаўленаму МП заставацца або перамяшчацца ў мэтавую вобласць.Гэтыя даследаванні таксама дазволілі нам вызначыць канфігурацыі магнітаў, якія максімальна павялічваюць колькасць часціц, якія застаюцца ў трахеі пасля адкладу.У другой серыі даследаванняў мы імкнуліся выкарыстаць гэтую аптымальную канфігурацыю, каб прадэманстраваць схему трансдукцыі ў выніку дастаўкі in vivo LV-MPs у дыхальныя шляхі пацукоў, мяркуючы, што дастаўка LV-MPs у кантэксце нацэльвання на дыхальныя шляхі прывядзе да у павышэнні эфектыўнасці трансдукции ЛЖ..
Усе даследаванні на жывёл праводзіліся ў адпаведнасці з пратаколамі, зацверджанымі Універсітэтам Адэлаіды (M-2019-060 і M-2020-022) і Камітэтам па этыцы жывёл на сінхратроне SPring-8.Эксперыменты праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі ARRIVE.
Усе рэнтгенаўскія здымкі былі зроблены на лініі прамяня BL20XU на сінхратроне SPring-8 у Японіі з выкарыстаннем устаноўкі, аналагічнай апісанай раней 21,22.Калі коратка, то эксперыментальны бокс знаходзіўся ў 245 м ад назапашвальніка сінхротрона.Адлегласць ад узору да дэтэктара 0,6 м выкарыстоўваецца для даследаванняў візуалізацыі часціц і 0,3 м для даследаванняў in vivo для стварэння эфектаў фазавага кантрасту.Выкарыстоўваўся манахраматычны пучок з энергіяй 25 кэВ.Выявы былі атрыманы з дапамогай рэнтгенаўскага пераўтваральніка з высокім дазволам (SPring-8 BM3), злучанага з дэтэктарам sCMOS.Датчык пераўтворыць рэнтгенаўскае выпраменьванне ў бачнае святло з дапамогай сцынцілятара таўшчынёй 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12), які затым накіроўваецца на датчык sCMOS з дапамогай аб'ектыва мікраскопа ×10 (NA 0,3).Дэтэктар sCMOS быў Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Японія) з памерам масіва 2048 × 2048 пікселяў і памерам неапрацаванага пікселя 6,5 × 6,5 мкм.Гэты параметр дае эфектыўны ізатропны памер пікселя 0,51 мкм і поле зроку прыблізна 1,1 мм × 1,1 мм.Працягласць уздзеяння 100 мс была выбрана для максімальнага павелічэння суадносін сігнал/шум магнітных часціц унутры і па-за дыхальных шляхоў пры мінімізацыі артэфактаў руху, выкліканых дыханнем.Для даследаванняў in vivo на шляху рэнтгенаўскага выпраменьвання быў размешчаны хуткі рэнтгенаўскі затвор, каб абмежаваць дозу радыяцыі, блакуючы рэнтгенаўскі пучок паміж экспазіцыямі.
Носьбіт LV не выкарыстоўваўся ні ў якіх даследаваннях візуалізацыі SPring-8 PB-PCXI, таму што камера для візуалізацыі BL20XU не мае сертыфікацыі біябяспекі ўзроўню 2.Замест гэтага мы абралі шэраг добра ахарактарызаваных MP ад двух камерцыйных пастаўшчыкоў, якія ахопліваюць дыяпазон памераў, матэрыялаў, канцэнтрацый жалеза і прымянення - спачатку для таго, каб зразумець, як магнітныя палі ўплываюць на рух MP ў шкляных капілярах, а потым у жывыя дыхальныя шляхі.паверхні.Памер МП вар'іруецца ад 0,25 да 18 мкм і вырабляецца з розных матэрыялаў (гл. Табліцу 1), але склад кожнага ўзору, у тым ліку памер магнітных часціц у МП, невядомы.Грунтуючыся на нашых шырокіх даследаваннях MCT 19, 20, 21, 23, 24, мы чакаем, што MP да 5 мкм можна ўбачыць на паверхні дыхальных шляхоў трахеі, напрыклад, шляхам аднімання паслядоўных кадраў, каб убачыць палепшаную бачнасць руху MP.Адно MP у 0,25 мкм меншае, чым раздзяляльнасць прылады візуалізацыі, але PB-PCXI, як чакаецца, выявіць іх аб'ёмны кантраст і рух паверхневай вадкасці, на якую яны наносяцца пасля нанясення.
Узоры для кожнага дэпутата ў табліцы.1 быў падрыхтаваны ў 20 мкл шкляных капіляраў (Drummond Microcaps, Пенсільванія, ЗША) з унутраным дыяметрам 0,63 мм.Карпускулярныя часціцы даступныя ў вадзе, у той час як часціцы CombiMag даступныя ў запатэнтаванай вадкасці вытворцы.Кожную прабірку напалову запаўняюць вадкасцю (прыблізна 11 мкл) і змяшчаюць на трымальнік узору (гл. малюнак 1).Шкляныя капіляры былі размешчаны гарызантальна на сцэне ў камеры візуалізацыі адпаведна і размешчаны па краях вадкасці.Магніт з нікелевай абалонкай дыяметрам 19 мм (28 мм у даўжыню), выраблены з рэдказямельных элементаў, неадыму, жалеза і бору (NdFeB) (N35, каталожны нумар LM1652, Jaycar Electronics, Аўстралія) з рэшткавай намагнічнасцю 1,17 Тл быў прымацаваны да асобная табліца перадачы для дасягнення Выдалена змяніць сваё становішча падчас рэндэрынгу.Рэнтгенаўскі здымак пачынаецца, калі магніт размяшчаецца прыблізна на 30 мм над узорам, і выявы атрымліваюць з частатой 4 кадра ў секунду.Падчас візуалізацыі магніт набліжалі да шкляной капілярнай трубкі (на адлегласці каля 1 мм), а затым перамяшчалі ўздоўж трубкі, каб ацаніць уплыў напружанасці поля і становішча.
Ўстаноўка візуалізацыі in vitro, якая змяшчае ўзоры MP у шкляных капілярах на этапе трансляцыі ўзору xy.Шлях рэнтгенаўскага прамяня пазначаны чырвонай пункцірнай лініяй.
Пасля таго, як была ўстаноўлена бачнасць MP in vitro, іх падмноства было пратэставана in vivo на самках пацукоў-альбіносаў Wistar дзікага тыпу (ва ўзросце ~12 тыдняў, ~200 г).Медетомидин 0,24 мг/кг (Domitor®, Zenoaq, Японія), мидазолам 3,2 мг/кг (Dormicum®, Astellas Pharma, Японія) і буторфанол 4 мг/кг (Vetorphale®, Meiji Seika).Пацукоў анестэзіравалі сумессю Pharma (Японія) шляхам внутрибрюшинного ўвядзення.Пасля анестэзіі іх падрыхтавалі да візуалізацыі, выдаліўшы поўсць вакол трахеі, уставіўшы эндотрахеальную трубку (ET; нутравенныя канюлі 16 Ga, Terumo BCT) і абезрухоміўшы іх у становішчы лежачы на ​​спецыяльна вырабленай пласціне для візуалізацыі, якая змяшчае цеплавы мяшок для падтрымання тэмпературы цела.22. Затым пласціну для візуалізацыі прымацавалі да століка для ўзору ў скрынцы для візуалізацыі пад невялікім вуглом, каб выраўнаваць трахею гарызантальна на рэнтгенаўскім здымку, як паказана на малюнку 2a.
(a) Налада візуалізацыі in vivo ў блоку візуалізацыі SPring-8, шлях рэнтгенаўскага прамяня пазначаны чырвонай пункцірнай лініяй.(B, C) Лакалізацыя магніта трахеі была выканана дыстанцыйна з дапамогай двух артаганальна ўстаноўленых IP-камер.З левага боку выявы на экране вы бачыце драцяную пятлю, якая трымае галоўку, і дастаўляльную канюлю, усталяваную ўнутры трубкі ET.
Сістэма шпрыца з дыстанцыйным кіраваннем (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, штат Фларыда) з выкарыстаннем шклянога шпрыца на 100 мкл была падлучана да трубкі PE10 (0,61 мм OD, 0,28 мм ID) з дапамогай іголкі 30 Ga.Адзначце трубку, каб пераканацца, што наканечнік знаходзіцца ў правільным становішчы ў трахеі пры ўстаўцы эндотрахеальной трубкі.З дапамогай мікрапомпы поршань шпрыца выдалілі, а кончык трубкі пагрузілі ва ўзор MP, які трэба даставіць.Загружаную трубку для дастаўкі затым устаўлялі ў эндотрахеальную трубку, размяшчаючы наканечнік у самай моцнай частцы нашага чаканага магнітнага поля.Атрыманне выявы кантралявалася з дапамогай дэтэктара дыхання, падлучанага да нашай скрынкі часу на базе Arduino, і ўсе сігналы (напрыклад, тэмпература, дыханне, адкрыццё/закрыццё засаўкі і атрыманне выявы) запісваліся з дапамогай Powerlab і LabChart (AD Instruments, Сіднэй, Аўстралія) 22 Пры візуалізацыі Калі корпус быў недаступны, дзве IP-камеры (Panasonic BB-SC382) былі размешчаны прыблізна пад вуглом 90° адна да адной і выкарыстоўваліся для кантролю становішча магніта адносна трахеі падчас візуалізацыі (малюнак 2b, c).Каб звесці да мінімуму артэфакты руху, адзін відарыс на ўдых быў атрыманы падчас канчатковага плато дыхальнага патоку.
Магніт прымацаваны да другой ступені, якая можа быць размешчана выдалена на вонкавым боку корпуса візуалізацыі.Былі пратэставаны розныя пазіцыі і канфігурацыі магніта, у тым ліку: размешчаны пад вуглом прыкладна 30° над трахеяй (канфігурацыі паказаны на малюнках 2а і 3а);адзін магніт над жывёлай, а другі знізу, з полюсамі, устаноўленымі для прыцягнення (малюнак 3b)., адзін магніт над жывёлай і адзін унізе, з полюсамі, устаноўленымі для адштурхвання (малюнак 3c), і адзін магніт уверсе і перпендыкулярна трахеі (малюнак 3d).Пасля ўстаноўкі жывёлы і магніта і загрузкі доследнага МП у шпрыц-помпу дастаўце дозу 50 мкл з хуткасцю 4 мкл/с пасля атрымання малюнкаў.Затым магніт перамяшчаюць уздоўж або папярок трахеі, працягваючы атрымліваць выявы.
Канфігурацыя магніта для візуалізацыі in vivo (a) адзін магніт над трахеяй прыблізна пад вуглом 30°, (b) два магніты, настроеныя для прыцягнення, (c) два магніты, настроеныя на адштурхванне, (d) адзін магніт над і перпендыкулярна трахеі.Назіральнік глядзеў уніз ад рота да лёгкіх праз трахею, і рэнтгенаўскі прамень прайшоў праз левы бок пацукі і выйшаў з правага боку.Магніт альбо перамяшчаюць па даўжыні дыхальных шляхоў, альбо налева і направа над трахеяй у напрамку рэнтгенаўскага прамяня.
Мы таксама імкнуліся вызначыць бачнасць і паводзіны часціц у дыхальных шляхах пры адсутнасці змешвання дыхання і сардэчнага рытму.Такім чынам, у канцы перыяду візуалізацыі жывёл падвяргалі гуманнай эўтаназіі з-за перадазіроўкі пентабарбіталу (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ЗША; ~65 мг/кг унутрычэраўна).Некаторых жывёл пакідалі на платформе візуалізацыі, і пасля спынення дыхання і сэрцабіцця працэс візуалізацыі паўтаралі, дадаючы дадатковую дозу MP, калі MP не было бачна на паверхні дыхальных шляхоў.
Атрыманыя выявы былі скарэкціраваны для плоскага і цёмнага поля, а затым сабраны ў фільм (20 кадраў у секунду; 15–25 × звычайная хуткасць у залежнасці ад частаты дыхання) з выкарыстаннем спецыяльнага сцэнарыя, напісанага ў MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Усе даследаванні па дастаўцы вектара гена LV праводзіліся ў Цэнтры лабараторных даследаванняў жывёл Універсітэта Адэлаіды і мелі на мэце выкарыстоўваць вынікі эксперыменту SPring-8 для ацэнкі таго, ці можа дастаўка LV-MP у прысутнасці магнітнага поля ўзмацніць перанос генаў in vivo .Для ацэнкі ўздзеяння МП і магнітнага поля апрацоўвалі дзве групы жывёл: адной групе ўводзілі МЖ ЛЖ з устаноўкай магніта, а другой групе - кантрольную групу МЖ ЛЖ без магніта.
Генныя вектары LV былі атрыманы з выкарыстаннем раней апісаных метадаў 25, 26.Вектар LacZ экспрэсіруе ген бэта-галактазідазы, лакалізаваны ў ядры, які кіруецца канстытутыўным прамоўтарам MPSV (LV-LacZ), які стварае сіні прадукт рэакцыі ў трансдуцыраваных клетках, бачны на пярэдняй частцы і зрэзах лёгачнай тканіны.Тытраванне праводзілі ў культурах клетак шляхам ручнога падліку колькасці LacZ-станоўчых клетак з дапамогай гемоцитометра для разліку тытра ў TU/мл.Носьбіты крыякансервуюць пры тэмпературы -80°C, размарожваюць перад выкарыстаннем і звязваюць з CombiMag шляхам змешвання 1:1 і інкубацыі на лёдзе не менш за 30 хвілін перад дастаўкай.
Нармальныя пацукі Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3 пад наркозам у/б сумессю 0,4 мг/кг медетомидина (Domitor, Ilium, Аўстралія) і 60 мг/кг кетаміну (Ilium, Аўстралія) ва ўзросце 1 месяца) ip ) ін'екцыі і нехірургічнае канюляванне ротавай паражніны з дапамогай нутравенных канюль 16 Ga.Каб пераканацца, што тканіна дыхальных шляхоў трахеі атрымлівае трансдукцыю ЛЖ, яе кандыцыянавалі з выкарыстаннем нашага раней апісанага пратакола механічных узрушэнняў, у якім паверхню дыхальных шляхоў трахеі расціралі ў восевым кірунку драцяным кошыкам (N-круг, нітынолавы экстрактар ​​без наканечніка NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ЗША) 30 с.28.Затым, прыкладна праз 10 хвілін пасля пертурбации ў биобезопасном кабінеце, правялі трахеальное ўвядзенне ЛВ-МП.
Магнітнае поле, якое выкарыстоўвалася ў гэтым эксперыменце, было наладжана аналагічна рэнтгенаўскаму даследаванню in vivo з такімі ж магнітамі, якія ўтрымліваліся над трахеяй з дапамогай дыстыляцыйных заціскаў для стэнтаў (малюнак 4).Аб'ём 50 мкл (2 х 25 мкл аліквоты) LV-MP быў дастаўлены ў трахею (n = 3 жывёл) ​​з дапамогай піпеткі з гелевым наканечнікам, як апісана раней.Кантрольная група (n = 3 жывёл) ​​атрымлівала такі ж LV-MP без выкарыстання магніта.Пасля завяршэння інфузорыя канюлю выдаляюць з эндотрахеальной трубкі і жывёла экстубируют.Магніт застаецца на месцы 10 хвілін перад выдаленнем.Пацукам падскурна ўводзілі мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Аўстралія) з наступнай адменай анестэзіі шляхам внутрибрюшинной ін'екцыі 1 мг/кг гідрахларыд атыпамазола (Antisedan, Zoetis, Аўстралія).Пацукоў трымалі ў цяпле і назіралі да поўнага выхаду з наркозу.
Прылада дастаўкі ЛВ-МП у шафе біялагічнай бяспекі.Вы бачыце, што светла-шэрая гільза Luer-lock трубкі ET выступае з рота, а наканечнік гелевай піпеткі, паказаны на малюнку, уводзіцца праз трубку ET на патрэбную глыбіню ў трахею.
Праз тыдзень пасля працэдуры ўвядзення LV-MP жывёл забівалі па-чалавечы шляхам інгаляцыі 100% CO2 і ацэньвалі экспрэсію LacZ з дапамогай нашага стандартнага лячэння X-gal.Тры самых хваставых храстковых кольцы былі выдалены, каб гарантаваць, што любыя механічныя пашкоджанні або затрымка вадкасці з-за размяшчэння эндотрахеальной трубкі не будуць уключаны ў аналіз.Кожную трахею разразалі ўздоўж, каб атрымаць дзве паловы для аналізу, і змяшчалі ў кубак, які змяшчае сіліконавы каўчук (Sylgard, Dow Inc), выкарыстоўваючы іголку Minutien (Fine Science Tools) для візуалізацыі паверхні прасвету.Размеркаванне і характар ​​трансдуцированных клетак былі пацверджаны франтальнай фатаграфіяй з выкарыстаннем мікраскопа Nikon (SMZ1500) з камерай DigiLite і праграмным забеспячэннем TCapture (Tucsen Photonics, Кітай).Выявы былі атрыманы пры 20-кратным павелічэнні (уключаючы максімальную наладу для поўнай шырыні трахеі), пры гэтым уся даўжыня трахеі адлюстроўвалася крок за крокам, забяспечваючы дастатковае перакрыцце паміж кожным малюнкам, каб выявы маглі быць "злучаны".Выявы з кожнай трахеі затым былі аб'яднаны ў адзін кампазітны малюнак з дапамогай Composite Image Editor версіі 2.0.3 (Microsoft Research) з выкарыстаннем алгарытму планарнага руху. Плошча экспрэсіі LacZ у кампазітных малюнках трахеі кожнай жывёлы была вызначана колькасна з дапамогай аўтаматызаванага скрыпта MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней28, з выкарыстаннем налад 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 і Value < 0,7. Плошча экспрэсіі LacZ у кампазітных малюнках трахеі кожнай жывёлы была вызначана колькасна з дапамогай аўтаматызаванага скрыпта MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней28, з выкарыстаннем налад 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 і Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ у складзеных малюнках трахеяў ад кожнага жывёльнага была колькасна вызначана з выкарыстаннем значэння аўтаматызаванага сцэнарыя MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней28, з выкарыстаннем параметраў 0,35 <оттенок <0,58, насычанасць> 0,15 і <0 ,7. Плошча экспрэсіі LacZ у кампазітных выявах трахеі кожнай жывёлы была вызначана колькасна з дапамогай аўтаматызаванага скрыпта MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней28 з выкарыстаннем налад 0,350,15 і значэнне <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。 ………………………………………………………………. Вобласці экспрэсіі LacZ на складзеных малюнках трахеяў кожнага жывёльнага колькасці вызначаны з дапамогай аўтаматызаванага сцэнарыя MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней, з выкарыстаннем параметраў 0,35 <оттенок <0,58, насычанасць> 0,15 і значэнне <0,7 . Вобласці экспрэсіі LacZ на кампазіцыйных выявах трахеі кожнай жывёлы вызначалі колькасна з дапамогай аўтаматызаванага скрыпта MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней, з выкарыстаннем налад 0,35 < адценне < 0,58, насычанасць > 0,15 і значэнне < 0,7.Шляхам адсочвання контураў тканіны ў GIMP v2.10.24 для кожнага састаўнога відарыса ўручную была створана маска для ідэнтыфікацыі вобласці тканіны і прадухілення любых ілжывых выяўленняў па-за тканінай трахеі.Афарбаваныя плошчы ўсіх кампазітных малюнкаў кожнай жывёлы былі сумаваныя, каб атрымаць агульную афарбаваную плошчу гэтай жывёлы.Затым афарбаваную плошчу падзялілі на агульную плошчу маскі, каб атрымаць нармалізаваную плошчу.
Кожную трахею залівалі ў парафін і рабілі зрэзы таўшчынёй 5 мкм.Зрэзы афарбоўвалі нейтральным хуткім чырвоным на працягу 5 хвілін, а выявы рабілі з дапамогай мікраскопа Nikon Eclipse E400, камеры DS-Fi3 і праграмнага забеспячэння для захопу элементаў NIS (версія 5.20.00).
Усе статыстычныя аналізы праводзіліся ў GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Статыстычная значнасць была ўстаноўлена на р ≤ 0,05.Нармальнасць была праверана з дапамогай тэсту Шапіра-Уілка, а адрозненні ў афарбоўцы LacZ ацэньваліся з дапамогай няпарнага t-тэсту.
Шэсць MP, апісаных у табліцы 1, былі даследаваны PCXI, а бачнасць апісана ў табліцы 2. Два полістырольныя MP (MP1 і MP2; 18 мкм і 0,25 мкм адпаведна) не былі бачныя PCXI, але астатнія ўзоры можна было ідэнтыфікаваць. (прыклады паказаны на малюнку 5).MP3 і MP4 слаба бачныя (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм і 0,9 мкм адпаведна).Нягледзячы на ​​тое, што MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) утрымліваў адны з самых дробных пратэставаных часціц, ён быў найбольш выяўленым.Прадукт CombiMag MP6 цяжка адрозніць.Ва ўсіх выпадках наша здольнасць выяўляць МЖ была значна палепшана шляхам перамяшчэння магніта наперад і назад паралельна капіляру.Калі магніты аддаляліся ад капіляра, часціцы выцягваліся доўгімі ланцужкамі, але калі магніты набліжаліся і напружанасць магнітнага поля павялічвалася, ланцужкі часціц скарачаліся, калі часціцы мігравалі да верхняй паверхні капіляра (гл. Дадатковае відэа S1 : MP4), павялічваючы шчыльнасць часціц на паверхні.І наадварот, калі магніт выдаляецца з капіляра, напружанасць поля памяншаецца, і MPs перабудоўваюцца ў доўгія ланцужкі, якія ідуць ад верхняй паверхні капіляра (гл. дадатковае відэа S2: MP4).Пасля таго, як магніт спыняе рух, часціцы працягваюць рухацца яшчэ некаторы час пасля дасягнення становішча раўнавагі.Калі MP рухаецца да верхняй паверхні капіляра і ад яе, магнітныя часціцы імкнуцца ўцягваць смецце праз вадкасць.
Бачнасць MP пад PCXI значна адрозніваецца паміж узорамі.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 і (d) MP6.Усе выявы, паказаныя тут, былі зроблены з дапамогай магніта, размешчанага прыкладна ў 10 мм непасрэдна над капілярам.Відавочныя вялікія кругі - гэта бурбалкі паветра, захопленыя ў капілярах, якія выразна паказваюць чорныя і белыя краі фазавага кантрасту.Чырвонае поле паказвае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць.Звярніце ўвагу, што дыяметры ланцугоў магнітаў на ўсіх малюнках не ў маштабе і прыблізна ў 100 разоў большыя, чым паказана.
Калі магніт рухаецца ўлева і ўправа ўздоўж вяршыні капіляра, вугал струны МП змяняецца, каб выраўнавацца з магнітам (гл. малюнак 6), такім чынам акрэсліваючы лініі магнітнага поля.Для MP3-5, пасля таго як хорда дасягае парогавага вугла, часціцы цягнуцца па верхняй паверхні капіляра.Гэта часта прыводзіць да таго, што MPs аб'ядноўваюцца ў вялікія групы побач з месцам, дзе магнітнае поле найбольш моцнае (гл. дадатковае відэа S3: MP5).Гэта таксама асабліва відавочна пры візуалізацыі блізка да канца капіляра, што выклікае агрэгацыю і канцэнтрацыю MP на мяжы вадкасці і паветра.Часціцы ў MP6, якія было цяжэй адрозніць, чым у MP3-5, не цягнуліся, калі магніт рухаўся ўздоўж капіляра, але струны MP дысацыявалі, пакідаючы часціцы ў полі зроку (гл. дадатковае відэа S4: MP6).У некаторых выпадках, калі прыкладзенае магнітнае поле памяншалася шляхам перамяшчэння магніта на вялікую адлегласць ад месца візуалізацыі, любыя пакінутыя МП пад дзеяннем сілы цяжару павольна апускаліся на ніжнюю паверхню трубы, застаючыся ў струне (гл. дадатковае відэа S5: MP3) .
Вугал струны МП змяняецца пры руху магніта ўправа над капілярам.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 і (d) MP6.Чырвонае поле паказвае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць.Калі ласка, звярніце ўвагу, што дадатковыя відэа прызначаныя для інфармацыйных мэтаў, паколькі яны раскрываюць важную структуру часціц і дынамічную інфармацыю, якую немагчыма візуалізаваць на гэтых статычных малюнках.
Нашы тэсты паказалі, што павольнае перамяшчэнне магніта наперад і назад уздоўж трахеі палягчае візуалізацыю MF у кантэксце складанага руху in vivo.Тэсты in vivo не праводзіліся, таму што шарыкі полістыролу (MP1 і MP2) не былі бачныя ў капіляры.Кожны з астатніх чатырох MF быў пратэставаны in vivo з доўгай воссю магніта, размешчанай над трахеяй пад вуглом каля 30° да вертыкалі (гл. малюнкі 2b і 3a), так як гэта прывяло да больш доўгіх ланцугоў MF і было больш эфектыўным. чым магніт..канфігурацыя спынена.MP3, MP4 і MP6 не знойдзены ў трахеях жывых жывёл.Пры візуалізацыі дыхальных шляхоў пацукоў пасля забойства жывёл гуманным спосабам часціцы заставаліся нябачнымі нават пры даданні дадатковага аб'ёму з дапамогай шпрыцавага помпы.MP5 меў самае высокае ўтрыманне аксіду жалеза і быў адзінай бачнай часціцай, таму яго выкарыстоўвалі для ацэнкі і характарыстыкі паводзін MP in vivo.
Размяшчэнне магніта над трахеяй падчас увядзення MF прывяло да таго, што многія, але не ўсе, MF былі сканцэнтраваны ў полі зроку.Пранікненне часціц у трахею лепш за ўсё назіраецца ў жывёл, падвергнутых гуманнай эўтаназіі.Малюнак 7 і дадатковае відэа S6: MP5 паказвае хуткі магнітны захоп і выраўноўванне часціц на паверхні вентральнай трахеі, што паказвае на тое, што MP можна нацэліць на патрэбныя вобласці трахеі.Пры пошуку больш дыстальна ўздоўж трахеі пасля дастаўкі MF некаторыя MF былі знойдзены бліжэй да кіля, што паказвае на недастатковую напружанасць магнітнага поля для збору і ўтрымання ўсіх MF, паколькі яны былі дастаўлены праз вобласць максімальнай напружанасці магнітнага поля падчас увядзення вадкасці.працэс.Тым не менш, пасляродавыя канцэнтрацыі MP былі вышэй вакол вобласці выявы, што сведчыць аб тым, што многія MP заставаліся ў рэгіёнах дыхальных шляхоў, дзе напружанасць магнітнага поля была самай высокай.
Выявы (а) да і (б) пасля дастаўкі MP5 у трахею нядаўна падвергнутай эўтаназіі пацука з дапамогай магніта, размешчанага непасрэдна над вобласцю візуалізацыі.Намаляваны ўчастак размяшчаецца паміж двума храстковымі кольцамі.У дыхальных шляхах ёсць некаторая колькасць вадкасці перад дастаўкай МП.Чырвонае поле паказвае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць.Гэтыя выявы ўзяты з відэа, прадстаўленага ў S6: MP5 Supplementary Video.
Перасоўванне магніта ўздоўж трахеі in vivo прывяло да змены вугла ланцуга MP на паверхні дыхальных шляхоў, падобна таму, што назіраецца ў капілярах (гл. малюнак 8 і дадатковае відэа S7: MP5).Тым не менш, у нашым даследаванні MPs нельга было перацягнуць па паверхні жывых дыхальных шляхоў, як гэта маглі зрабіць капіляры.У некаторых выпадках ланцуг MP даўжэе, калі магніт рухаецца налева і направа.Цікава, што мы таксама выявілі, што ланцуг часціц змяняе глыбіню павярхоўнага пласта вадкасці, калі магніт перамяшчаецца ўздоўж трахеі, і пашыраецца, калі магніт перамяшчаецца прама над галавой і ланцуг часціц паварочваецца ў вертыкальнае становішча (гл. Дадатковае відэа S7).: MP5 на 0:09, унізе справа).Характэрная карціна руху змянялася, калі магніт перамяшчалі латэральна па верхняй частцы трахеі (г.зн. злева або справа ад жывёлы, а не ўздоўж даўжыні трахеі).Часціцы ўсё яшчэ былі добра бачныя падчас іх руху, але калі магніт быў выдалены з трахеі, сталі бачныя кончыкі нітак часціц (гл. дадатковае відэа S8: MP5, пачынаючы з 0:08).Гэта ўзгадняецца з назіраным паводзінамі магнітнага поля пад дзеяннем прыкладзенага магнітнага поля ў шкляным капіляры.
Прыклады малюнкаў, якія паказваюць MP5 у трахеі жывога пацука пад наркозам.(a) Магніт выкарыстоўваецца для атрымання малюнкаў над і злева ад трахеі, затым (b) пасля перамяшчэння магніта направа.Чырвонае поле паказвае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць.Гэтыя выявы ўзяты з відэа, прадстаўленага ў дадатковым відэа S7: MP5.
Калі два полюса былі настроены ў арыентацыі з поўначы на ​​поўдзень вышэй і ніжэй трахеі (г.зн. прыцягваючы; мал. 3b), хорды МП выглядалі даўжэйшымі і размяшчаліся на бакавой сценцы трахеі, а не на дорсальной паверхні трахеі. трахеі (гл. Дадатак).Відэа S9: MP5).Аднак высокія канцэнтрацыі часціц у адным месцы (г.зн. на дорсальной паверхні трахеі) не былі выяўленыя пасля ўвядзення вадкасці з дапамогай прылады з падвойным магнітам, што звычайна адбываецца з прыладай з адным магнітам.Затым, калі адзін магніт быў сканфігураваны для адштурхвання супрацьлеглых полюсаў (малюнак 3c), колькасць часціц, бачных у полі зроку, не павялічылася пасля родаў.Наладзіць дзве канфігурацыі магнітаў складана з-за высокай напружанасці магнітнага поля, якое прыцягвае або штурхае магніты адпаведна.Затым устаноўку змянілі на адзін магніт, размешчаны паралельна дыхальным шляхам, але які праходзіць праз дыхальныя шляхі пад вуглом 90 градусаў, так што сілавыя лініі перасякаюць сценку трахеі артаганальна (малюнак 3d), арыентацыя, прызначаная для вызначэння магчымасці агрэгацыі часціц на бакавой сценкі.назірацца.Аднак у гэтай канфігурацыі не было ідэнтыфікаванага руху назапашвання МП або руху магніта.На падставе ўсіх гэтых вынікаў канфігурацыя з адным магнітам і 30-градуснай арыентацыяй была абраная для даследаванняў носьбітаў генаў in vivo (мал. 3а).
Калі жывёлу здымалі некалькі разоў адразу пасля таго, як яе прынеслі ў ахвяру па-чалавечы, адсутнасць перашкаджаючых рухаў тканін азначала, што ў выразным межхрастковом полі можна было адрозніць больш тонкія і кароткія лініі часціц, якія «хісталіся» ў адпаведнасці з паступальным рухам магніта.выразна бачыць прысутнасць і рух часціц MP6.
Тытр LV-LacZ складаў 1,8 х 108 МЕ/мл, і пасля змешвання 1:1 з CombiMag MP (MP6) жывёлам ўводзілі 50 мкл трахеальнай дозы 9 х 107 МЕ/мл носьбіта LV (г.зн. 4,5 х 106 TU/пацук).).).У гэтых даследаваннях замест таго, каб перамяшчаць магніт падчас родаў, мы зафіксавалі магніт у адным становішчы, каб вызначыць, ці можна (а) палепшыць трансдукцыю ЛЖ у параўнанні з вектарнай дастаўкай пры адсутнасці магнітнага поля і (б) ці могуць дыхальныя шляхі быць засяроджаным.Клеткі, якія трансдуцыруюцца ў вобласці магнітных мэтаў верхніх дыхальных шляхоў.
Наяўнасць магнітаў і выкарыстанне CombiMag у спалучэнні з вектарамі ЛЖ не аказалі негатыўнага ўплыву на здароўе жывёлы, як і наш стандартны пратакол дастаўкі вектара ЛЖ.Франтальныя выявы вобласці трахеі, падвергнутай механічным уздзеянням (дадатковы малюнак 1), паказалі, што група, якая атрымлівала LV-MP, мела значна больш высокі ўзровень трансдукцыі ў прысутнасці магніта (мал. 9а).Толькі невялікая колькасць блакітнага афарбоўвання LacZ прысутнічала ў кантрольнай групе (малюнак 9b).Колькасная ацэнка афарбаваных X-Gal нармалізаваных абласцей паказала, што ўвядзенне LV-MP у прысутнасці магнітнага поля прывяло да паляпшэння прыкладна ў 6 разоў (мал. 9с).
Прыклад зборных малюнкаў, якія паказваюць трахеальную трансдукцыю з LV-MP (а) у прысутнасці магнітнага поля і (б) у адсутнасць магніта.(c) Статыстычна значнае паляпшэнне нармалізаванай вобласці трансдукцыі LacZ у трахеі з выкарыстаннем магніта (*p = 0,029, t-тэст, n = 3 на групу, сярэдняе ± стандартная памылка сярэдняга).
Нейтральныя хутка афарбаваныя ў чырвоны колер зрэзы (прыклад паказаны на дадатковым малюнку 2) сведчаць аб тым, што клеткі, афарбаваныя LacZ, прысутнічалі ў тым самым узоры і ў тым самым месцы, як паведамлялася раней.
Ключавой праблемай геннай тэрапіі дыхальных шляхоў застаецца дакладная лакалізацыя часціц-носьбітаў у цікавых зонах і дасягненне высокага ўзроўню эфектыўнасці трансдукцыі ў рухомым лёгкім пры наяўнасці паветранага патоку і актыўнага ачышчэння слізі.Для носьбітаў ЛЖ, прызначаных для лячэння рэспіраторных захворванняў пры мукавісцыдозу, павелічэнне часу знаходжання часціц носьбіта ў праводзяць дыхальных шляхах да гэтага часу было недасягальнай мэтай.Як адзначылі Кастэлані і інш., выкарыстанне магнітных палёў для ўзмацнення трансдукцыі мае перавагі перад іншымі метадамі дастаўкі генаў, такімі як электрапарацыя, таму што можа спалучаць у сабе прастату, эканамічнасць, лакалізаваную дастаўку, павышаную эфектыўнасць і меншы час інкубацыі.і, магчыма, меншая доза транспартнага сродку10.Аднак адклад in vivo і паводзіны магнітных часціц у дыхальных шляхах пад уздзеяннем знешніх магнітных сіл ніколі не былі апісаны, і фактычна здольнасць гэтага метаду павялічваць узровень экспрэсіі генаў у дыхальных шляхах непашкоджаных жывых не была прадэманстравана in vivo.
Нашы эксперыменты in vitro на сінхратроне PCXI паказалі, што ўсе часціцы, якія мы пратэставалі, за выключэннем полістыролу MP, былі бачныя ў выкарыстоўванай намі ўсталёўцы візуалізацыі.У прысутнасці магнітнага поля магнітныя палі ўтвараюць струны, даўжыня якіх звязана з тыпам часціц і сілай магнітнага поля (г.зн. блізкасцю і рухам магніта).Як паказана на малюнку 10, струны, якія мы назіраем, утвараюцца, калі кожная асобная часціца намагнічваецца і індукуе ўласнае лакальнае магнітнае поле.Гэтыя асобныя палі прымушаюць іншыя падобныя часціцы збірацца і злучацца з групавымі рухамі струны з-за мясцовых сіл ад мясцовых сіл прыцягнення і адштурхвання іншых часціц.
Дыяграма, якая паказвае (a, b) ланцужкі часціц, якія ўтвараюцца ўнутры запоўненых вадкасцю капіляраў, і (c, d) запоўненую паветрам трахею.Звярніце ўвагу, што капіляры і трахеі не намаляваны ў маштабе.Панэль (а) таксама змяшчае апісанне МЖ, які змяшчае часціцы Fe3O4, размешчаныя ў ланцугі.
Калі магніт рухаўся над капілярам, ​​кут нахілу струны часціц дасягнуў крытычнага парога для MP3-5, які змяшчае Fe3O4, пасля чаго струна часціц больш не заставалася ў зыходным становішчы, а рухалася па паверхні ў новае становішча.магніт.Верагодна, гэты эфект узнікае таму, што паверхня шклянога капіляра дастаткова гладкая, каб гэты рух мог адбывацца.Цікава, што MP6 (CombiMag) не паводзіў сябе такім чынам, магчыма, таму, што часціцы былі меншымі, мелі іншае пакрыццё або зарад паверхні, або запатэнтаваная вадкасць-носьбіт паўплывала на іх здольнасць рухацца.Кантраст у выяве часціц CombiMag таксама слабейшы, што сведчыць аб тым, што вадкасць і часціцы могуць мець аднолькавую шчыльнасць і таму не могуць лёгка рухацца адна да адной.Часціцы таксама могуць затрымацца, калі магніт рухаецца занадта хутка, што паказвае на тое, што напружанасць магнітнага поля не заўсёды можа пераадолець трэнне паміж часціцамі ў вадкасці, мяркуючы, што напружанасць магнітнага поля і адлегласць паміж магнітам і мэтавай вобласцю не павінны выглядаць як сюрпрыз.важны.Гэтыя вынікі таксама паказваюць, што, хоць магніты могуць захопліваць шмат мікрачасціц, якія працякаюць праз мэтавую вобласць, малаверагодна, што магніты могуць разлічваць на перамяшчэнне часціц CombiMag па паверхні трахеі.Такім чынам, мы прыйшлі да высновы, што даследаванні МЖ ЛЖ in vivo павінны выкарыстоўваць статычныя магнітныя палі для фізічнага нацэльвання на пэўныя вобласці дрэва дыхальных шляхоў.
Калі часціцы дастаўляюцца ў арганізм, іх цяжка ідэнтыфікаваць у кантэксце складанай рухомай тканіны цела, але здольнасць іх выяўлення была палепшана шляхам гарызантальнага перамяшчэння магніта над трахеяй, каб «варушыць» струны MP.Нягледзячы на ​​тое, што візуалізацыя ў рэжыме рэальнага часу магчымая, лягчэй распазнаць рух часціц пасля таго, як жывёла была забіта гуманным чынам.Канцэнтрацыі MP звычайна былі самымі высокімі ў гэтым месцы, калі магніт быў размешчаны над вобласцю візуалізацыі, хоць некаторыя часціцы звычайна знаходзіліся далей у трахеі.У адрозненне ад даследаванняў in vitro, часціцы не могуць быць перацягнуты ў трахею рухам магніта.Гэтая выснова супадае з тым, як слізь, якая пакрывае паверхню трахеі, звычайна апрацоўвае ўдыхальныя часціцы, затрымліваючы іх у слізі і пасля ачышчаючы іх з дапамогай механізму мукоцилиарного клірансу.
Мы выказалі здагадку, што выкарыстанне магнітаў вышэй і ніжэй трахеі для прыцягнення (мал. 3b) можа прывесці да больш аднастайнага магнітнага поля, а не магнітнага поля, якое моцна сканцэнтравана ў адной кропцы, патэнцыйна прыводзячы да больш аднастайнага размеркавання часціц..Аднак наша папярэдняе даследаванне не знайшло відавочных доказаў, якія пацвярджаюць гэтую гіпотэзу.Сапраўды гэтак жа ўстаноўка пары магнітаў на адштурхванне (мал. 3c) не прывяла да большага асядання часціц у вобласці малюнка.Гэтыя дзве знаходкі дэманструюць, што ўстаноўка з падвойным магнітам істотна не паляпшае лакальны кантроль навядзення MP і што ў выніку моцныя магнітныя сілы цяжка наладзіць, што робіць гэты падыход менш практычным.Аналагічным чынам арыентацыя магніта над і папярок трахеі (малюнак 3d) таксама не павялічвае колькасць часціц, якія застаюцца ў вобласці выявы.Некаторыя з гэтых альтэрнатыўных канфігурацый могуць быць непаспяховымі, паколькі яны прыводзяць да памяншэння напружанасці магнітнага поля ў зоне адкладання.Такім чынам, канфігурацыя аднаго магніта пры 30 градусах (мал. 3а) лічыцца самым простым і найбольш эфектыўным метадам тэставання in vivo.
Даследаванне LV-MP паказала, што калі вектары LV спалучаліся з CombiMag і дастаўляліся пасля фізічнага ўздзеяння ў прысутнасці магнітнага поля, узровень трансдукцыі ў трахеі значна павялічваўся ў параўнанні з кантрольнай групай.На падставе даследаванняў сінхратроннай візуалізацыі і вынікаў LacZ, магнітнае поле аказалася здольным утрымліваць ЛЖ у трахеі і памяншаць колькасць вектарных часціц, якія неадкладна пранікаюць глыбока ў лёгкія.Такія паляпшэнні таргетынгу могуць прывесці да павышэння эфектыўнасці пры адначасовым зніжэнні дастаўленых тытраў, нямэтавай трансдукцыі, запаленчых і імунных пабочных эфектаў і выдаткаў на перанос генаў.Важна адзначыць, што, па словах вытворцы, CombiMag можна выкарыстоўваць у спалучэнні з іншымі метадамі пераносу генаў, уключаючы іншыя вірусныя вектары (напрыклад, AAV) і нуклеінавыя кіслоты.